盐水致大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞中HSP60及ras蛋白的表达(1)
 |
 |
 |
[摘 要]目的 研究盐水灌胃导致的大鼠萎缩性胃炎(CAG)胃黏膜组织细胞HSP60及ras表达状态， 以探讨长期高盐饮食与慢性萎缩性胃炎发生的关系。方法 采用盐水灌胃建立大鼠萎缩性胃炎动物模型，选取大鼠腺胃胃窦组织行激光扫描共聚焦显微镜标本制备并对组织细胞结构的变化进行动态观察。结果 正常组胃粘膜组织细胞未见阳性表达，盐水组在第24周，在细胞浆中可见HSP60及ras表达，呈均质颗粒状，到32周及65周时表达更加明显。双标记中可见HSP60和ras共同表达。结论 盐水长期灌胃可导致胃粘膜出现萎缩，在此过程中，HSP60和ras蛋白参与了重要的调节过程。
关键词：盐水 胃粘膜 HSP60 ras 免疫荧光 激光扫描共聚焦显微镜
中图分类号：R573.3 文献标示码：B 文章编号：1005-0019(2008)4-0019-03
ras与细胞内的信号传递、增殖、分化有关，在肠化、异型增生的上皮中均有阳性表达，参与多种肿瘤的形成与发展。热休克蛋白(HSP)与细胞的转化和恶变过程密切相关[1]， HSP通过调控细胞周期所必需的蛋白构象参与细胞的增殖和死亡过程。本研究利用激光扫描共聚焦显微镜( laser scanning confocal microscope， LSCM)的高分辨性及同屏显示不同发射波长荧光色的特性，观察上述两种蛋白在大鼠萎缩性胃炎胃粘膜组织细胞中的表达情况。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料
7周龄健康、性成熟的雄性SD大鼠(由第四军医动物实验中心提供)64只，体质量200g~250g，按随机化原则分为3组，即正常喂养组、正常对照组和盐水组。每组各20只。采用架式笼养，恒温(24±1)℃，湿度50%～60%。
1.2 方法
1.2.1 大鼠萎缩性胃炎模型的制作
正常喂养组为正常喂养，饮白开水；正常对照组为25℃白开水灌胃，每次2.5mL，1次•d-1；盐水组为15%盐水灌胃，每次2.5mL，1次•d-1。实验开始，先处死4只正常组大鼠，并留取胃大体标本作为对照。以后各组分别于8W、12W、24W、32W、65W各随机取4只，以观察粘膜萎缩情况，具体方法参见文献[2]。
, 百拇医药
按身体质量与给药容积比值为0.5%腹腔注射戊巴比妥麻醉，取出鼠胃，沿大弯剪开作大体观察，包括粘膜的色泽、弹性、皱襞多少、粘液是否丰富。沿大鼠胃小弯条状取材，包括胃窦及部分胃体，做病理切片，HE染色后进行组织学观察。参照1994年美国休斯顿胃炎诊断分类标准[3]及2000年国内井冈山胃炎诊断分类标准，对粘膜厚度、胃小凹颈部粘膜宽度及细胞厚度进行测量。组织切片由专人采取盲法阅片。统计学方法采用t检验。
1.2.2 免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜检测技术
按身体质量与给药容积比值为0.5%腹腔注射戊巴比妥麻醉，取出鼠胃，沿大鼠胃小弯条状取材，包括胃窦及部分胃体，做组织切片。
胃黏膜组织HSP60和ras蛋白表达采用激光共聚焦免疫荧光双标方法。所需仪器(荧光显微镜、恒温箱、荧光分光光度仪、电镜、共焦镜等)由第四军医大学提供，免疫荧光双标记检测试剂盒由武汉博士德公司提供。
, 百拇医药
具体步骤：①将组织切片在二甲苯中浸3次，每次10min；脱蜡后切片依次浸入1000 ml•L-1、950 ml•L-1、700ml•L-1梯度乙醇中脱二甲苯，每次2min；至蒸馏水中浸5 min，0.01mol•L-1的PBS振洗3次，每次5 min；正常山羊血清封闭，37℃，30 min；②分别滴加50mol/L的1：1混合的兔抗大鼠ras (1：100)和小鼠抗大鼠HSP60(1：200)，设空白对照(无一抗，加PBS)和抗体特异性对照(加一抗不加二抗，加二抗不加一抗)，所有切片同时染色。切片一抗加入后，置于湿盒内，4℃，过夜；③取出后37℃复温60 min，0.01mol• L-1的PBS振洗3次，每次5 min；免疫荧光双标记分别滴加50mol/L的 1：1混合的FITC标记的羊抗小鼠IgG和罗丹明标记羊抗兔IgG，37℃，40 min；0.01mol• L-1 的PBS振洗3次，每次5 min；10%的缓冲甘油封片；④激光扫描共聚焦显微镜观察所用LSCM的型号为MRC-1024，装有Zeis100显微镜，用于FITC的激发波长为488nm，568nm用于激发Texas Red，用于图像采集的显微镜物镜为Plan-Neofluar 40x 油浸镜，数值孔径(NA)为1.3，图像存为512×512像素类型，焦距值设为1.0，若需要更大的放大倍数时，可以选择更大的焦距值范围，扫描所用的激光值依据样本不同可以在共聚焦系统提供的梯值中选择。
, 百拇医药
2 结果
光镜结果显示，正常对照组于灌胃8，12，32 wk时黏膜表面光滑，无糜烂，固有层无炎细胞浸润，黏膜下层无水肿，肌层无炎细胞浸润。正常对照组于灌胃65 wk时可见黏膜肌层平滑肌轻度增生，呈钉突状向黏膜肌层插入，黏膜出现轻度萎缩改变。盐水组于盐水灌胃后第24wk大鼠胃黏膜出现腺体明显缩小，黏膜肌层的平滑肌呈束状增生插入黏膜固有层中. 腺体上1/3至2/3腺上皮萎缩，腺管腔增宽，胃小凹颈部黏膜宽度变窄，第32wk时大鼠胃黏膜萎缩更加明显(图1)。激光共聚焦显微镜观察显示：正常组胃粘膜组织细胞未见阳性表达，盐水组在第24周，在细胞浆中可见HSP60和ras表达，呈均质颗粒状，到32周及65周时表达更加明显。双标记中可见HSP60和ras共同表达(见图2、3、4、5、6、7、8、9)。
图1 大鼠胃黏膜病理变化 (×200). A： 正常对照组，黏膜表面光滑，无糜烂，固有层无炎细胞浸润，黏膜下层无水肿，肌层无炎细胞浸润；B：正常对照组65 wk时可见黏膜肌层平滑肌轻度增生，呈钉突状向黏膜肌层插入，黏膜出现轻度萎缩改变；C：盐水组24 wk，腺体明显缩小，黏膜肌层的平滑肌呈束状增生插入黏膜固有层中.腺体上1/3至2/3腺上皮萎缩，腺管腔变大，胃小凹颈部黏膜宽度变窄.
, 百拇医药
3 讨论
研究认为，慢性萎缩性胃炎的病理形成主要是各种致病因素的长期刺激或继发的宿主炎症反应，导致胃粘膜深层损害和腺体破坏，使胃粘膜不能完全修复再生，从而形成胃粘膜腺体萎缩和(或)肠化。近年来流行病学研究表明，慢性萎缩性胃炎与胃癌发生密切相关，其被列为胃癌前状态[4]。长期高盐饮食可以导致慢性萎缩性胃炎，甚至诱发癌变[5] ，而在此过程中，HSP和ras的参与起着重要的调节作用。
人类ras原癌家庭包括同源的H-ras，K-ras，N-ras，分别定位于不同的染色体片段上，在不同的肿瘤具有优势激活现象，但均编码分子量为21KD的十分相似的P21蛋白，与细胞内的信号传递、增殖、分化有关，参与多种肿瘤的形成与发展。本研究发现，随着盐水灌胃时间延长，胃黏膜逐渐出现萎缩，黏膜组织中ras蛋白表达亦呈逐渐增加趋势，提示在盐水灌胃导致胃黏膜组织细胞病变的早期阶段ras蛋白表达较高。有研究认为，ras 基因改变是一个早期改变，提示细胞正处于恶性转化状态，预示体内存在肿瘤发生潜在的可能。ras在肠化、异型增生的上皮中均有阳性表达，反应了具有肠型上皮分化特征的细胞和组织的存在，是粘膜柱状上皮向肠化上皮分化的结果，可以作为监测胃粘膜病变发生的一个早期标志[6]。ras基因的激活与细胞增长、增殖有关，特别是H-ras基因与胃癌关系较为密切，其所编码的蛋白质ras p21具有调节细胞生长和分化的功能，它的异常表达对细胞恶性表型起着重要作用。, 百拇医药(张玲霞 张 沥 陶 梅 宋 瑛 曹广周)