核苷(酸)类似物相关HBV P基因区耐药变异的调查分析(1)
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[摘要]目的调查分析本地区HBV P基因区的RT基因序列变异及基因型耐药情况。指导临床对核苷(酸)类似物的合理应用。方法对核苷(酸)类似物抗病毒治疗中出现HBV P基因区耐药的患者进行调查分析。结果LAM相关变异中，以rtM204V变异为主。ADV相关变异中，以rtA181V位点变异为主。181A为拉米夫定和阿德福韦酯耐药发生的交叉位点。结论在长期应用NA抗病毒治疗时，定期检测HBV-DNA，并对出现病毒学突破的病例进行HBV P基因耐药检测，依据检测结果实行个体化治疗，避免无效治疗。
关键词：乙肝核苷(酸)类似物P基因区耐药变异
中图分类号：R511 文献标识码：B 文章编号：1004-7484(2011)11-0222-03
HBV P基因区表达HBV聚合酶，NA抗病毒作用是因为可以抑制聚合酶的活性，因此HBV P区基因位点变异可引起相关NA的耐药导致治疗无效。通过检测这些与耐药相关的基因位点是否存在变异，就可断定治疗中的HBV是否产生了耐药性。耐药基因监测早期发现乙肝病毒耐药变异对于临床给予有效的挽救治疗，包括撤换或增加其他NA具有重要意义。
1材料与方法
1.1 研究对象来源及入选标准
2009年7月21日～2011年2月10日潍坊地区各医院门诊及住院的乙肝患者，符合2005版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准，HBsAg阳性、患者在服用核苷(酸)类似物过程中，发生了病毒学突破或者不充分病毒学应答。
1.2 主要检测项目和方法
HBV P区变异检测：HBV P区耐药变异检测试剂盒：美国ABI BigDye 3.1 测序试剂盒，日本TaKaRa生物公司的ExTaq酶。仪器为美国ABI 310遗传分析仪，采用基因直接测序法，检测已知的核苷(酸)类似物相关HBV P区变异。本次研究检测HBV P基因RT区已知的13个耐药基因位点：80、169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、241、250位点。
1.3 统计学分析
用SPSS16.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量指标用均数±标准差(x±S)来表示。
2结果
2.1 病人资料
在接受抗病毒药物治疗前，患者的年龄、性别以及HBeAg等基本情况，见表1。
表174例CHB患者治疗前基本资料
年龄
(岁)性别(
例数)HBeA
g(例数)ALT(
U/L)HBV-DN
A(log
10copies/
ml)肝
硬
化
男女阳性阴性
38.1±11.34232393595±18.57.8±2.4无
2.2 HBV PCR产物扩增产物直接测序法检测结果
HBV P基因区阳性的样本共60例，阳性率为81.1%(60/74)。拉米夫定相关50例，阳性率为87.7%(50/57)，ADV相关变异共检出10例，阳性率为58.8%(10/17)，见表2。
表2HBV PCR 产物扩增测序结果
药物耐药例数阳性率(%)
拉米夫定5087.7
阿德福韦酯1058.8
替比福定00
恩替卡韦00
合计6081.1
2.3 拉米夫定相关变异
本研究共检测出拉米夫定相关的耐药点有5个，5个突变位点了组合10种模式。92%(23/25)rtM204V伴有rtL180M，25%(4/16)rtM204I伴有rtL180M，21.9%(7/32)rtM204+rtL180M伴有rtV173L变异，见表3。
表350例拉米夫定相关突变的模式及构成情况
变异模式耐药情况例数构成比(%)
rtM204V+rtL180MLAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降1530
rtM204ILAM耐药，LdT耐药1122
rtM204V+rtV173L+rtL180MLAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降714
rtM204V/I+rtL180MLAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降510
rtM204I+rtL180MLAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降48
rtM204VLAM耐药，LdT耐药24
rtM204V/ILAM耐药，LdT耐药24
rtA181TLAM耐药，ADV耐药24
rtM204I+rtV173LLAM耐药，LdT耐药12
rtM204V+rtL180M+rtT184SLAM耐药，LdT耐药，ETV敏感性下降12
2.4 ADV相关变异
本研究共检测出ADV相关的耐药点有2个，2个突变位点组合了4种模式。rtA181V变异共6例(60%)，其中(3/6)伴有rtN236T，见表4。
表410例阿德福韦酯相关突变的模式及构成情况
变异模式耐药情况例数构成比(%)
rtA181V+rtN236TADV耐药330
rtA181VADV耐药330
rtN236TADV耐药220
rtA181TLAM耐药， ADV耐药220
2.5 拉米夫定和阿德福韦酯耐药位点的比较
HBV P基因位点181A为拉米夫定和阿德福韦酯耐药发生的重合位点。变异为181T时表现为LAM和ADV的双重耐药。变异为181V时仅发生ADV耐药。
2.6 核苷(酸)类似物耐药情况
通过耐药基因分析显示，与LAM和ADV相关HBV的基因发生了耐药突变。本文60个病例均未服用过替比夫定和恩替卡韦。由于有些变异位点表现NA交叉耐药，LAM的相关基因(rtA181T除外)变异也导致了LdT的耐药发生，替比夫定对LAM相关变异的耐药率为96%(48/50)；LAM相关变异(rtM204V/I+rtL180M)会造成ETV的抗病毒敏感性下降，发生率为10%(5/50)。
2.7 耐药变异后的病毒学特征 ......
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