牛奶中青霉素残留量检测的方法学探索①(3)
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2010年8月1日
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4.1 青霉素溶剂的选择
青霉素类抗生素含有羧基,是一类有机酸,其pka值为2.5～2.8[21],因此选用pH值为2.5的0.1mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液,使其酸化而游离出。在预实验中,曾采用 Milli-Q Synthesis超纯水,作为青霉素的溶剂,忽略了水对青霉素的水解作用,造成26% 至40% 的低回收率。考虑到流动相(KH2PO4 :乙腈=7:3)既可游离出青霉素,又对青霉素具有一定的保护作用,因此选用流动相作为青霉素的溶剂。
4.2 浓缩温度的选择
实验前期,曾在50～60℃ 之间,对样品进行减压浓缩。由于青霉素对热不稳定,较高的温度会催化其分子重排和使其结构分解,从而使青霉素的β-内酰胺环受到破坏[22],致使回收率较低。于是将浓缩温度降为40℃,有效避免青霉素结构的破坏,得到较高的回收率。
4.3 蛋白沉淀剂的选择
甲醇和乙腈是液相色谱分析中常用的蛋白沉淀剂。甲醇沉淀蛋白会产生絮状蛋白沉淀物,而乙腈则产生较细的蛋白沉淀,易于上清液的分离。采用乙腈沉淀蛋白还有利于保护色谱柱,并且沉淀蛋白的能力较甲醇强[23-25],再者使用乙腈作为蛋白沉淀剂和本实验流动相中的有机相一致,因此在本实验中选用乙腈为蛋白沉淀剂。
4.4 样品前处理方法的选择:
预实验中,最初采用液-液萃取法[26],即:用乙腈脱蛋白,漩涡离心后收集上清液到分液漏斗中,分别加入30mL正己烷和30mL二氯甲烷,二者互溶主要起净化、脱脂和去除非极性干扰物的作用,分离5分钟后出现乳化层,反复几次上机检测均获得较低回收率,考虑到萃取率太低,反复萃取提高萃取率的办法又需要太多时间,因此选择减压浓缩的方法。
4.5 pH值对青霉素保留时间的影响
在调制磷酸二氢钾缓冲溶液pH值,测定青霉素保留时间时发现, pH 值越小,青霉素保留时间越长,反之亦然。利用这个性质,可以通过调节缓冲液的pH值,来调整青霉素保留时间,使青霉素峰与杂质峰之间,达到较好的分离度。致使最终选择了pH值为2.5,使青霉素的保留时间在6分钟左右。
5 小结
初步建立了反高效液相色谱法测定牛奶中青霉素残留量的方法,在目前研究的实验条件下方法达到可接受的精密度、回收率要求。青霉素标准溶液在4℃ 条件下的稳定性比 20℃ 条件下的稳定性好。
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