MMP-9和COX-2在肾癌组织中的表达水平及临床意义(1)
【摘要】 目的 探讨肾癌患者肿瘤组织中基质金属蛋白酶9(MMP-9)及环氧合酶2(COX-2)的表达水平及其临床意义。方法 收集50例肾癌患者术后癌组织及20例肾良性病变手术后的肾组织(均经术后病理及影像学等检查确定)，并按相应步骤进行切片，分别采用免疫组织化学PV6000两步法测定肾肿瘤组织中两种肿瘤标记物的表达水平，并进行统计学分析。结果 肾癌患者肿瘤组织中的MMP-9及COX-2水平均较良性对照组染色明显(P<0.05)。其中肾癌组MMP-9的阳性率为86%，而COX-2在肾癌组中的阳性率为82%，二者表达水平明显呈正相关(r=0.039，P<0.05)。结论 肾癌组织中MMP-9及COX-2都存在着过度表达，且二者均随肿瘤病理分级的增高而表达进一步强烈，证明二者在肾癌的发生、发展、浸润及转移中发挥重要作用
【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶9；环氧合酶2
肾细胞癌(RCC)是泌尿系统常见肿瘤，在各种泌尿系统肿瘤中其发病率仅次于膀胱癌居第二位，其生物学特征多变，易复发和转移，同时也是全身多发的实质脏器恶性肿瘤之一。其临床早期诊断及治疗一直是医学界研究的热点和难题。近年来，环氧合酶-2(COX-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在RCC发展中的作用日益受到人们的关注。本项研究利用免疫组织化学法对肾癌组织中的COX-2及MMP-9表达进行测定，同时结合肾癌的临床病理等方面特征，探究二者在肾癌发展过程中的作用和意义，旨在为肾癌的早期诊断及分子水平研究提供依据。1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 肾癌组 收集青岛大学医学院附属医院2010年3月至2011年4月间手术切除且经病理诊断为原发性肾癌的手术标本50例，以AJCC(2002版)的TNM分期为标准，其中T1期患者28例，T2期患者15例，T3期患者6例，T4期患者1例；其中男32例，女18例，年龄36-68岁，平均(52.7 8.1)岁。所有患者均排除外伤、严重的感染性疾病或者其他系统疾病。
1.1.2 对照组 肾良性及健康对照组20人，均为我院经检查后确诊者，其中肾结石6人，肾囊肿10人，因外伤行肾部分切者4人(经影像学及实验室检查，最后经手术予以确定)。所有患者均排除心肺、肠胃等重要脏器疾病，肝肾功能试验正常，无肿瘤家族史。所有参选病人均经实验室和物理检查、腹部超声、及螺旋CT等检查诊断。
1.1.3 标本采集 免疫组织化学所需标本均经自青医附院病理科获得，经一名经验丰富的技师4μm切片备用。
1.2 检测方法
1.2.1 仪器及试剂 显微镜为德国Leica 4000B荧光倒置显微镜，一抗分别为兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体，兔抗人环氧合酶。
1.2.2 单克隆抗体、磷酸盐缓冲液(PBS)，DAB显色试剂盒，PV6000即用型免疫组化染色试剂盒。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化操作步骤按照说明书进行。
1.2.3 采用PV6000两步法测定组织中COX-2及MMP-9水平：经4μm切片的组织标本脱蜡入水，其操作过程严格按说明书进行。MMP-9判读标准：染色阳性为胞浆内出现棕色和棕黄色，显微镜下组织被染成棕黄色的为阳性(+)，其阳性细胞数<40%；成棕色为阳性(++)，其阳性细胞数40%-80%；成深棕色(+++)，其阳性细胞数>80%；组织没有着色为阴性[1]。COX-2判读标准：阳性表达定位于细胞浆，呈浅黄色至深棕色，阳性判定标准依据阳性细胞数和阳性反应强度两项指标，阳性着色数>10%定位阳性表达，阳性反应强度为浅黄色为弱阳性定位(+)、黄色或者棕黄色为中等阳性定为(++)、棕色或者深棕色定为强阳性定为(+++)，无棕黄色或者背景着色一致为阴性[2]。
1.3 统计学方法 检测结果采用SPSS软件处理，组间比较行X2检验，两因素间采用非参数检验的Spearman相关分析，显著性检验均为双侧检验，显著性水平设定为P﹤0.05。2 结 果
2.1 MMP-9及COX-2在肾癌组中的表达水平 二者在肾癌组的表达(见表1)，经X2检验可以得出二者在肾癌组检测中的阳性率无统计学差异(P>0.05)。MMP-9定位于癌细胞膜、胞质、细胞间质和部分肿瘤组织间质中，以肿瘤细胞表达为主，见图1，而COX-2定位于癌细胞膜、胞质内，见图2；其中RCC组中MMP-9的阳性表达率为86%，COX-2的阳性表达率为82%，二者的相关性分析表明其在肾癌组中呈明显正相关(r=0.039，P<0.05)。
表1 MMP-9及COX-2在肾癌组表达水平情况
COX-2 MMP-9
阳性(例) 阴性(例)
合计
阳性 35 6 41
阴性 8 1 9
合计 43 7 50
2.2 COX-2及MMP-9在肾癌组及对照组中的表达情况比较 对肾癌组及肾良性病变组中COX-2及MMP-9表达进行统计学分析后发现，二者表达水平分别在两组中的差异具有统计学意义(P<0.05)，且两项指标之间的表达水平具有强烈正相关性(r=0.512，P<0.05)。
2.3 COX-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系 经Spearman相关分析检验后发现，COX-2和MMP-9在RCC中的阳性表达率与肿瘤大小、病理分期和转移情况无明显相关性(P>0.05)，而COX-2及MMP-9与RCC的临床组织学分级分别都有明显相关性(r=0.051，r=0.297)，其差异具有统计学意义(P<0.05)。3 讨 论
肾细胞癌(RCC)是最常见的肾脏恶性肿瘤，发病率约占全身恶性肿瘤的3%，其中又以肾透明细胞癌(Clear renal cell carcinoma，CRCC)为常见。由于肾癌的症状比较隐匿，早期难以发现，临床上20%-35%就诊时已发生转移，预后多不良，并且死亡人数呈逐年上升趋势[3]。, http://www.100md.com(王鹏举 刁会丰 李慎谦 孙立江)
【关键词】 肾癌；基质金属蛋白酶9；环氧合酶2
肾细胞癌(RCC)是泌尿系统常见肿瘤，在各种泌尿系统肿瘤中其发病率仅次于膀胱癌居第二位，其生物学特征多变，易复发和转移，同时也是全身多发的实质脏器恶性肿瘤之一。其临床早期诊断及治疗一直是医学界研究的热点和难题。近年来，环氧合酶-2(COX-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在RCC发展中的作用日益受到人们的关注。本项研究利用免疫组织化学法对肾癌组织中的COX-2及MMP-9表达进行测定，同时结合肾癌的临床病理等方面特征，探究二者在肾癌发展过程中的作用和意义，旨在为肾癌的早期诊断及分子水平研究提供依据。1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 肾癌组 收集青岛大学医学院附属医院2010年3月至2011年4月间手术切除且经病理诊断为原发性肾癌的手术标本50例，以AJCC(2002版)的TNM分期为标准，其中T1期患者28例，T2期患者15例，T3期患者6例，T4期患者1例；其中男32例，女18例，年龄36-68岁，平均(52.7 8.1)岁。所有患者均排除外伤、严重的感染性疾病或者其他系统疾病。
1.1.2 对照组 肾良性及健康对照组20人，均为我院经检查后确诊者，其中肾结石6人，肾囊肿10人，因外伤行肾部分切者4人(经影像学及实验室检查，最后经手术予以确定)。所有患者均排除心肺、肠胃等重要脏器疾病，肝肾功能试验正常，无肿瘤家族史。所有参选病人均经实验室和物理检查、腹部超声、及螺旋CT等检查诊断。
1.1.3 标本采集 免疫组织化学所需标本均经自青医附院病理科获得，经一名经验丰富的技师4μm切片备用。
1.2 检测方法
1.2.1 仪器及试剂 显微镜为德国Leica 4000B荧光倒置显微镜，一抗分别为兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体，兔抗人环氧合酶。
1.2.2 单克隆抗体、磷酸盐缓冲液(PBS)，DAB显色试剂盒，PV6000即用型免疫组化染色试剂盒。以上试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化操作步骤按照说明书进行。
1.2.3 采用PV6000两步法测定组织中COX-2及MMP-9水平：经4μm切片的组织标本脱蜡入水，其操作过程严格按说明书进行。MMP-9判读标准：染色阳性为胞浆内出现棕色和棕黄色，显微镜下组织被染成棕黄色的为阳性(+)，其阳性细胞数<40%；成棕色为阳性(++)，其阳性细胞数40%-80%；成深棕色(+++)，其阳性细胞数>80%；组织没有着色为阴性[1]。COX-2判读标准：阳性表达定位于细胞浆，呈浅黄色至深棕色，阳性判定标准依据阳性细胞数和阳性反应强度两项指标，阳性着色数>10%定位阳性表达，阳性反应强度为浅黄色为弱阳性定位(+)、黄色或者棕黄色为中等阳性定为(++)、棕色或者深棕色定为强阳性定为(+++)，无棕黄色或者背景着色一致为阴性[2]。
1.3 统计学方法 检测结果采用SPSS软件处理，组间比较行X2检验，两因素间采用非参数检验的Spearman相关分析，显著性检验均为双侧检验，显著性水平设定为P﹤0.05。2 结 果
2.1 MMP-9及COX-2在肾癌组中的表达水平 二者在肾癌组的表达(见表1)，经X2检验可以得出二者在肾癌组检测中的阳性率无统计学差异(P>0.05)。MMP-9定位于癌细胞膜、胞质、细胞间质和部分肿瘤组织间质中，以肿瘤细胞表达为主，见图1，而COX-2定位于癌细胞膜、胞质内，见图2；其中RCC组中MMP-9的阳性表达率为86%，COX-2的阳性表达率为82%，二者的相关性分析表明其在肾癌组中呈明显正相关(r=0.039，P<0.05)。
表1 MMP-9及COX-2在肾癌组表达水平情况
COX-2 MMP-9
阳性(例) 阴性(例)
合计
阳性 35 6 41
阴性 8 1 9
合计 43 7 50
2.2 COX-2及MMP-9在肾癌组及对照组中的表达情况比较 对肾癌组及肾良性病变组中COX-2及MMP-9表达进行统计学分析后发现，二者表达水平分别在两组中的差异具有统计学意义(P<0.05)，且两项指标之间的表达水平具有强烈正相关性(r=0.512，P<0.05)。
2.3 COX-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系 经Spearman相关分析检验后发现，COX-2和MMP-9在RCC中的阳性表达率与肿瘤大小、病理分期和转移情况无明显相关性(P>0.05)，而COX-2及MMP-9与RCC的临床组织学分级分别都有明显相关性(r=0.051，r=0.297)，其差异具有统计学意义(P<0.05)。3 讨 论
肾细胞癌(RCC)是最常见的肾脏恶性肿瘤，发病率约占全身恶性肿瘤的3%，其中又以肾透明细胞癌(Clear renal cell carcinoma，CRCC)为常见。由于肾癌的症状比较隐匿，早期难以发现，临床上20%-35%就诊时已发生转移，预后多不良，并且死亡人数呈逐年上升趋势[3]。, http://www.100md.com(王鹏举 刁会丰 李慎谦 孙立江)
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