高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型研究(1)
【摘 要】目的：探讨用C57BL小鼠建立高氧诱导的早产儿视网膜病变(ROP)动物模型，为研究该病的发病机制及治疗提供成熟的研究对象。方法：鼠龄为7天的新生C57BL小鼠随机分组，每组20只小鼠，将实验组小鼠置于密闭氧仓中饲养，氧仓连接氧浓度测量仪，保持氧箱内氧浓度为75±2%，5天后将小鼠取出置于常氧环境中饲养。对照组小鼠置于普通空气中饲养。两组小鼠均在出生后17天将小鼠处死，行眼球病理切片HE染色、视网膜新生血管细胞核计数及APD染色视网膜铺片，了解视网膜新生血管的形成情况。结果：正常对照组小鼠的视网膜组织切片中，内界膜清晰、连续，突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核极少，平均每张切片中为1.2±0.75个。实验组鼠视网膜组织切片中显示视网膜表面高低不平，较多突破内界膜的血管内皮细胞核，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为34.58±6.15个，与对照组相比，差异有非常显著的统计学意义。在视网膜铺片中对照组的视网膜血管发育成熟，自视盘发出向周边呈放射状均匀分布，血管形态及管径正常，分支血管发育良好。实验组可见视网膜血管迂曲变细，分布紊乱、周边大量无灌注区及新生血管芽形成。结论：高氧诱导的小鼠可成功形成视网膜新生血管，可以作为早产儿视网膜病变研究的成熟动物模型。
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【关键词】高氧， 早产儿视网膜病变，视网膜新生血管，动物模型
【中图分类号】R774.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0023-02
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity， ROP)是指新生儿视网膜血管异常增殖所致的一类疾病，是导致新生儿失明的最重要原因。[1，2]目前，该病的发病机制仍不明确。目前国内外对于ROP的最佳治疗仍局限于对阈值或阈值前病变进行光凝或冷凝，尽管如此仍有10%～15%的重症患儿最终失明[3，4]。因此，深入研究ROP的病理变化和发病机制，并采取有效措施阻断这一关键步骤，必将有利于ROP的治疗，对提高早产儿生存质量具有重要和实际的意义。同时在ROP的研究中选择一种合适的动物模型是ROP研究的重要实验基础。1994年Smith等设计的小鼠氧诱导视网膜病模型方法简单，可行性好，成功率高，因此该动物模型在ROP研究中得到了广泛的应用。本研究在此基础上，建立了氧诱导下的简单实用的ROP小鼠模型，以便进一步研究ROP的发病机制及研究其干预手段。
, 百拇医药
1 实验动物和方法
1.1 实验动物
健康C57BL/6J小鼠40只，鼠龄为7天，性别不限，与母鼠共同饲养，系清洁级动物。将无毒透明塑料箱的两端打孔，一端连接氧气，另一端连接测氧仪，两端连接处及箱盖与箱体连接处使用胶带封闭，塑料箱底铺石灰颗粒与木屑，保持容器内干燥。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立和分组 将其分为两组：⑴高氧组⑵正常对照组，每组幼鼠数量为20只，雌雄不限。高氧组的C57BL/J6小鼠出生后第七天，将实验幼鼠及哺乳母鼠放于塑料箱中暴露于75%氧气共5天，出生后第12天将小鼠转入正常空气房间。至出生后17天将小鼠处死，行眼球病理切片及视网膜铺片。
1.2.2 病理标本制作及视网膜新生血管细胞核计数 小鼠眼球常规于眼球甲醛固定液中固定，固定48小时候，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做一系列连续切片，厚度4-6微米，任意选取不包括视乳头的20张病理切片，在低倍镜下统计平均每张眼球切片突破视网膜内界膜而长入玻璃体内的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞细胞核时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞细胞核。
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1.2.3 ADP酶组织化学法染色的视网膜铺片 小鼠处死后摘出眼球，置于 10%福尔马林中 12 小时，在解剖显微镜下除去角膜、晶状体、脉络膜及巩膜。用毛笔扫除玻璃体以及视网膜外层的色素上皮，将游离视网膜以视乳头为中心放射状对称剪为4瓣，自来水冲洗 12 小时，在 37℃水浴箱中用 3%胰蛋白酶消化 7 小时，行ADP 酶组织化学法染色，封片后行光学显微镜观察结果并照相。
1.2.4 统计学分析 所有数据以统计分析软件SPSS16.0进行分析，数据以均数±标准差( x±s)表示，采用两组独立样本t检验分析方法比较各组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 两组视网膜血管形态的改变 正常对照组的视网膜铺片中，视网膜血管基本成熟，视网膜血管自视盘发出，向周边呈放射状均匀分布，血管走行直，分支较少且结构清晰，周边部视网膜血管网结构清晰，可见到少量无灌注区。视网膜血管可见分深浅两层。浅层血管呈放射状分支分布，深层血管呈多角形网状形态，两层血管网状结构通过螺旋形的交通动脉互相连接。高氧组可见视盘发出的大血管管径变细，分支减少，走行僵直，视网膜中央可见大片无灌注区，视网膜血管丧失了正常的放射状结构，有大量的视网膜新生血管，血管分布紊乱、走行迂曲，周边部血管密度增高，且浅层血管网及大部分深层血管网广泛闭塞。可见血管渗漏现象。两组的视网膜血管形态有很大的不同。
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2.2 视网膜血管内皮细胞核计数 正常对照组鼠龄为17天的视网膜组织切片中，内界膜清晰、连续，未发现或仅在少数切片中见到视网膜内界膜附近玻璃体内的血管内皮细胞核，平均每张切片中为1.2±0.75个。高氧组鼠视网膜组织切片中显示视网膜表面高低不平，神经节细胞层与神经纤维层出现大量新生血管，可见到较多突破内界膜的血管内皮细胞核，单独或成簇出现，有些甚至形成毛细血管腔，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为34.58±6.15个，与正常对照组相比，差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)，。
3 讨论
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity， ROP)是造成婴幼儿失明的最常见疾病，据统计我国每年有2000万新生儿出生，其中早产儿发生率为10%～15%，即每年约有200～300万早产儿出生，按一般的ROP发病率估计，我国每年将有约40～60万早产儿发生不同程度的ROP，每年至少约4～6万名早产儿受到失明的威胁[5]，因此ROP一直是眼科医师防盲治盲的重点课题。眼部的生理发育在胚胎早期视网膜没有血管，由玻璃体动脉供应营养。胎龄4个月时视网膜血管由视盘开始发育，逐渐向周边发展。胎龄34-36时血管发育到达鼻侧周边部分，直至40-42周，视网膜颞侧血管才发育成熟。因此，早产婴儿其周边视网膜血管尚未发育，在高氧的刺激下容易诱发新生血管的产生，这是早产儿视网膜病变的发病基础。[3]我们的临床统计发现早产儿胎龄越小，体重越轻的ROP的发病率越高。[6]目前ROP真正的发病机制还不清楚，研究认为在高浓度氧环境中促使早产儿未发育成熟的视网膜血管收缩、闭塞， 视网膜组织相对低氧， 从而引起一系列细胞因子，最主要是VEGF的分泌增加，促使异常的新生血管大量生成，导致出血即牵拉性视网膜脱离的严重并发症。, 百拇医药(唐松 钟华红 张国明)
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【关键词】高氧， 早产儿视网膜病变，视网膜新生血管，动物模型
【中图分类号】R774.1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0023-02
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity， ROP)是指新生儿视网膜血管异常增殖所致的一类疾病，是导致新生儿失明的最重要原因。[1，2]目前，该病的发病机制仍不明确。目前国内外对于ROP的最佳治疗仍局限于对阈值或阈值前病变进行光凝或冷凝，尽管如此仍有10%～15%的重症患儿最终失明[3，4]。因此，深入研究ROP的病理变化和发病机制，并采取有效措施阻断这一关键步骤，必将有利于ROP的治疗，对提高早产儿生存质量具有重要和实际的意义。同时在ROP的研究中选择一种合适的动物模型是ROP研究的重要实验基础。1994年Smith等设计的小鼠氧诱导视网膜病模型方法简单，可行性好，成功率高，因此该动物模型在ROP研究中得到了广泛的应用。本研究在此基础上，建立了氧诱导下的简单实用的ROP小鼠模型，以便进一步研究ROP的发病机制及研究其干预手段。
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1 实验动物和方法
1.1 实验动物
健康C57BL/6J小鼠40只，鼠龄为7天，性别不限，与母鼠共同饲养，系清洁级动物。将无毒透明塑料箱的两端打孔，一端连接氧气，另一端连接测氧仪，两端连接处及箱盖与箱体连接处使用胶带封闭，塑料箱底铺石灰颗粒与木屑，保持容器内干燥。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立和分组 将其分为两组：⑴高氧组⑵正常对照组，每组幼鼠数量为20只，雌雄不限。高氧组的C57BL/J6小鼠出生后第七天，将实验幼鼠及哺乳母鼠放于塑料箱中暴露于75%氧气共5天，出生后第12天将小鼠转入正常空气房间。至出生后17天将小鼠处死，行眼球病理切片及视网膜铺片。
1.2.2 病理标本制作及视网膜新生血管细胞核计数 小鼠眼球常规于眼球甲醛固定液中固定，固定48小时候，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做一系列连续切片，厚度4-6微米，任意选取不包括视乳头的20张病理切片，在低倍镜下统计平均每张眼球切片突破视网膜内界膜而长入玻璃体内的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞细胞核时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞细胞核。
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1.2.3 ADP酶组织化学法染色的视网膜铺片 小鼠处死后摘出眼球，置于 10%福尔马林中 12 小时，在解剖显微镜下除去角膜、晶状体、脉络膜及巩膜。用毛笔扫除玻璃体以及视网膜外层的色素上皮，将游离视网膜以视乳头为中心放射状对称剪为4瓣，自来水冲洗 12 小时，在 37℃水浴箱中用 3%胰蛋白酶消化 7 小时，行ADP 酶组织化学法染色，封片后行光学显微镜观察结果并照相。
1.2.4 统计学分析 所有数据以统计分析软件SPSS16.0进行分析，数据以均数±标准差( x±s)表示，采用两组独立样本t检验分析方法比较各组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。以P≤0.05为差异有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 两组视网膜血管形态的改变 正常对照组的视网膜铺片中，视网膜血管基本成熟，视网膜血管自视盘发出，向周边呈放射状均匀分布，血管走行直，分支较少且结构清晰，周边部视网膜血管网结构清晰，可见到少量无灌注区。视网膜血管可见分深浅两层。浅层血管呈放射状分支分布，深层血管呈多角形网状形态，两层血管网状结构通过螺旋形的交通动脉互相连接。高氧组可见视盘发出的大血管管径变细，分支减少，走行僵直，视网膜中央可见大片无灌注区，视网膜血管丧失了正常的放射状结构，有大量的视网膜新生血管，血管分布紊乱、走行迂曲，周边部血管密度增高，且浅层血管网及大部分深层血管网广泛闭塞。可见血管渗漏现象。两组的视网膜血管形态有很大的不同。
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2.2 视网膜血管内皮细胞核计数 正常对照组鼠龄为17天的视网膜组织切片中，内界膜清晰、连续，未发现或仅在少数切片中见到视网膜内界膜附近玻璃体内的血管内皮细胞核，平均每张切片中为1.2±0.75个。高氧组鼠视网膜组织切片中显示视网膜表面高低不平，神经节细胞层与神经纤维层出现大量新生血管，可见到较多突破内界膜的血管内皮细胞核，单独或成簇出现，有些甚至形成毛细血管腔，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为34.58±6.15个，与正常对照组相比，差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)，。
3 讨论
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity， ROP)是造成婴幼儿失明的最常见疾病，据统计我国每年有2000万新生儿出生，其中早产儿发生率为10%～15%，即每年约有200～300万早产儿出生，按一般的ROP发病率估计，我国每年将有约40～60万早产儿发生不同程度的ROP，每年至少约4～6万名早产儿受到失明的威胁[5]，因此ROP一直是眼科医师防盲治盲的重点课题。眼部的生理发育在胚胎早期视网膜没有血管，由玻璃体动脉供应营养。胎龄4个月时视网膜血管由视盘开始发育，逐渐向周边发展。胎龄34-36时血管发育到达鼻侧周边部分，直至40-42周，视网膜颞侧血管才发育成熟。因此，早产婴儿其周边视网膜血管尚未发育，在高氧的刺激下容易诱发新生血管的产生，这是早产儿视网膜病变的发病基础。[3]我们的临床统计发现早产儿胎龄越小，体重越轻的ROP的发病率越高。[6]目前ROP真正的发病机制还不清楚，研究认为在高浓度氧环境中促使早产儿未发育成熟的视网膜血管收缩、闭塞， 视网膜组织相对低氧， 从而引起一系列细胞因子，最主要是VEGF的分泌增加，促使异常的新生血管大量生成，导致出血即牵拉性视网膜脱离的严重并发症。, 百拇医药(唐松 钟华红 张国明)