胸水中SHOX2基因甲基化程度与肺癌的关系(3)

http://www.100md.com 2014年2月1日 栗少飞 聂立功

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     本实验尝试了这种新的甲基化研究方法HeavyMethyl分析方法。这种方法相对于传统的MSP方法具有以下优点[7]。(1)特异性高。MSP中，特异性主要取决于引物设计的特异性。如果在PCR初始循环中，MSP引物不适当的结合在非甲基化DNA上进行延伸，那么在其后的循环中此扩增产物及其互补产物将作为底物参与扩增。所以，MSP的特异性要求每个PCR循环中均无MSP引物错配。而HeavyMethyl则不同。因为其甲基化特异性是blocker赋予的，而blocker是无法扩增的，故在PCR循环过程中，blocker始终保持初始浓度，发挥相同的作用效率。所以，理论上来说，随着PCR循环次数的增多，HeavyMethyl的特异性越强，而MSP特异性越弱。(2)实验设计灵活性增加。由于HeavyMethyl的引物和探针并不需要跨越CpG岛，给了设计引物及探针更多的基因序列[8]。文献报导其正常人中有少量甲基化，大约在0.04%(支气管吸出物)、0.05%(血浆)以下，在50000pg非甲基化的SHOX2基因只能检测出15-25pg的甲基化SHOX2基因。本实验中应用了HeavyMethyl方法进行SHOX2基因的甲基化研究，在良性胸腔积液组中并未发现甲基化，与文献有差异，可能原因是：(1)甲基化SHOX2基因绝对数量过少。由于收集标本的方法所限，试验中使用的样本并非新鲜样本，一部分是在4℃冰箱中放置3天以上，未进行任何抗凝、防细胞破裂、防DNA降解、放细菌污染等措施，并且在提纯DNA前需将胸水从-20℃解冻，其中必然会有细胞破裂及DNA降解，亚硫酸氢盐转化过程中，同样有部分DNA被降解，由于良性胸腔积液中非甲基化SHOX2基因数量巨大 ......

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