汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定
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汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)的主要病毒,汉坦病毒的基因由 L、M、S 三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶, 囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白(简称核蛋白,Nucleocapsid Protein, NP)。血清学研究表明,汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,同时NP抗原可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应,表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定族。有鉴于此,我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化, 并用SDS-PAGE和Western-Blotting对重组核蛋白进行鉴定，为其应用于诊断抗原提供技术依据。
1材料与方法
1.1质粒与菌种
汉坦病毒76-118株由本室保存, 表达质粒pGEX-4T-1,菌株BL21从上海申友公司购买。
1.2单克隆抗体和血清
单克隆抗体由北京病毒所杭长寿教授和安徽医科大学倪大石教授惠赠；病人血清由上海市南汇区传染病医院提供。
1.3引物的设计与合成
上游：GAC CAG GAA TTC GCC CAT GAG GGT CAA TTA G ；下游： TCT GAA CTC GAG GAT GAT GCT CAG CCA GTC T。其PCR产物长度为334 bp,产物上游酶切位点为EcoRI;下游酶切位点为XhoI。
1.4模板制备
从HTNV 76-118株感染的Vero-E6细胞中提取总RNA作为模板。 用引物扩增出汉坦病毒S片段核心区域334 bp的片段,通过PCR反应获得目的片段,反应步骤如下：
每10 D引物溶于200 μL水中,模板取1μL溶于10 μL水中, 加样：模板 1 μL, 10X Buffer 5 μL, Mg2Cl (25mM) 3 μL,4dNTP (10 mM)1 μL,Primer-UP 1 μL, Primer-Down1 μL, Taq (5 U/μL)0 ......
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