上海市手足口病常见病原体基因分析
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引起婴幼儿手足口病(HFMD)的病原体是肠道病毒，人类是唯一已知的自然宿主，其中最常见的型别是肠道病毒71型(EV 71)和柯萨奇病毒16型(CA 16)。与CA 16相比较，EV 71的感染更有可能引起神经系统的症状或肺水肿而导致死亡[1~3]。肠道病毒主要经口或近距离飞沫感染或通过接触不洁物品传播。从2007年起，婴幼儿手足口病的疫情有所上升，2008年安徽阜阳出现规模较大的爆发疫情，其他省市也相继出现了手足口病感染病例，与去年同期相比有升高的趋势。为此，建立快速、灵敏、有效的检测方法并结合基因分析可为及时制定HFMD的防控措施提供依据。
1 材料与方法
1.1 EV 71和CA 16毒株来源
上海市疾病预防控制中心2000年大便监测标本经Vero细胞分离鉴定得到的毒株。经过3代RD细胞的转种后测得EV71和CA16病毒滴度(
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TCID50(lg)分别为7.25和6.75。
1.2 标本来源
标本来源于上海地区临床诊断HFMD患者咽拭子或疱疹液标本。用于本次研究的标本为随机抽取的经RD细胞培养鉴定后证实为EV 71和CA 16的阳性标本或阴性标本各6份。
1.3 核酸提取
取疱疹液或咽拭子标本液140 μL用于RNA提取。提取步骤参照试剂盒(QIAamp mini viral RNA kit，Qiagen公司)说明书，最后用60 μL洗脱液洗脱RNA作为RT-PCR扩增模板。
1.4 核酸扩增
使用PCR扩增仪(PE 9700，美国ABI公司)完成核酸扩增。反应试剂除引物外均定购于Promega公司，引物[2] 由上海基康生物技术有限公司合成。反应体系如下：5×buffer 10 μL，MgCl2(25 mmoL/L)4 μL，dNTPs(2.5 mmoL/L)5 μL，引物对(10 μmoL/L)各1.0 μL，AMV逆转录酶(10 U/μL)0.5 μL，Taq聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，RNA反应模板5 μL，用无酶水补足反应总量至50 μL。反应程序如下：42 ℃ 30 min逆转录，94 ℃ 5 min预变性，随后进行35个循环的94 ℃ 45 s变性；60℃ 45 s复性；72 ℃1 min延伸，最后72 ℃延长延伸时间至10 min。取8 μL扩增产物和2 μL上样缓冲液混匀后在1.5%的琼脂糖凝胶上以100 V恒压状态下电泳30 min左右，通过凝胶成像仪(GIS2010，中国天能公司)观察332 bp EV 71特异性扩增条带和211 bp CA16特异性扩增条带。
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1.5 测序产物预处理
使用Wizard(R)PCR Preps DNA Purification Systems(Promega公司)对扩增产物进行纯化。
EV 71型阳性扩增产物和CA 16型阳性扩增产物送上海基康生物技术有限公司进行测序。
核酸序列比对和分析应用DNA star生物基因分析软件包完成相关核苷酸序列的同源性分析和遗传进化树绘制。参比序列选用Genbank数据库中2003—2007年所得毒株的序列。
2 结果
2.1 咽拭子或疱疹液标本检测
对6份中和试验证实为EV 71型RD细胞培养液、6份CA 16型RD细胞培养液和6份RD细胞培养阴性标本进行肠道病毒EV 71型和CA 16型核酸检测，核酸检测结果与RD细胞培养鉴定结果一致。
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2.2 测序和比对
送交6份EV 71型PCR扩增产物和6份CA 16型PCR产物进行测序。将所得的测序结果递交Genbank数据库进行BLAST搜索，获得较高同源性的序列的序列编号分别为EU019910、AB433875、AM490125、DQ372648、AY905619、AY547499、AB213638、AF136379、AM292436、AY821796、AF177911、DQ993173。主要比对序列来自北京、浙江、台湾、深圳以及和我国比邻的日本、越南和马拉西亚。
2.3 核酸同源性以及遗传进化树分析
使用DNAstar软件包MegAlign中Clustal W程序对Genbank中搜索到的序列和测序序列进行核酸序列同源性比对。EV 71型标本核酸序列同源性范围为97.3%～98.9%；CA 16型标本核酸序列同源性范围为96.6%～97.7%(表1)。对同源性一致的序列进行归并，将4条EV 71型标本序列和3条CA 16型标本序列与Genbank数据库获得的序列进行比对并创建遗传进化树，结果显示，EV 71型核酸序列和CA 16型核酸序列完全处于两条大的分支上。EV 71型标本核酸序列和2007年北京递交于基因库中的序列在基因树上分布的位置更接近，CA 16型标本核酸序列和2005年马拉西亚递交的核酸序列在基因树上分布的位置更接近(图1)。
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3 讨论
手口足病是一种肠道传染病。1981年上海首先报道了HFMD病例，1995年武汉病毒所首次分离培养了EV 71型病毒。日本、马来西亚和台湾在上世纪末都有较大规模的爆发。散发和集中爆发的HFMD在全国各地每年时有发生。2007年起全国HFMD发病人数急剧上升，与去年同期相比，报告病例数上升508.26%。2007年上海报告的病例数为10 725例。2008年5月起HFMD被我国指定为《中华人民共和国传染病防治法》中的法定传染病。对于HFMD病原体检测，以前上海主要采用细胞培养鉴定法。所用检测周期长，不利于对于爆发疫情的病原体快速诊断。核酸扩增的方法快速、简便，能及时为防疫部门提供疫情爆发和常规监测的信息。
HFMD的好发年龄为<5岁的婴幼儿，好发季节为每年的5—8月。在今年发病高峰到来之前，收集临床诊断为HFMD患者的疱疹液或咽拭子标本进行核酸检测，并对随机抽取的6份EV 71型和6份CA 16型咽拭子或疱疹液进行细胞培养和核酸检测均为阳性的标本进行VP1区域核酸序列分析。结果显示,本市诊断HFMD的EV 71型病原体核酸序列和前5年基因库中的核酸序列相比，同源性为93.3%～98.9%；CA 16型病原体核酸序列和前5年的相比，同源性为92.4%～97.1%。标记为cell culture(EV 71型)的核酸序列为2000年儿童大便监测标本中分离鉴定得到，和本次患者的核酸序列同源性相比略有差异，与2003年、2004年递交的核酸序列同源性更接近，从基因树上分布的位置来看,也和今年的标本分布于不同的小分支上。
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近2年来HFMD发病数上升是否和基因特征的改变有关，本市今后是否会出现HFMD的疫情爆发，还有待于实验室继续监测和对数据的进一步分析。HFMD病原体基因分析方法的确立对监测数据的进一步分析，对辅助HFMD防治措施的完善是一种必不可少的手段。
4 参考文献
[1]田波，段海生，荣一兵，等. 肠道病毒71型分子流行病学研究进展[J]. 中国病毒学, 2004，19(4)：426-429.
[2]YAN J J, SU I J; CHEN P F,et al. Complete genome analysis of enterovirus 71 isolationed from an outbreak in Taiwan and rapid identification of enterovirus 71 and coxsackievirus A16 by RT-PCR[J].JMedVirol, 2001,65:331-339.
[3]恭黎明，葛琼，严菊英,等. 浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析[J].中华流行病学杂志,2005，12(26)：971-974.
(收稿日期：2008-06-16), 百拇医药(滕 峥 邵俊杰 朱兆奎 赵百慧 陈 敏)