【摘 要】 利用CRISPR/Cas9基因敲入技術建立稳定表达FUS(fused in sarcoma)的细胞系。方法：扩增FUS 5'arm序列，puro-T2A-GFP报告基因，FUS 3'arm序列，将3个片段一次连接至目的载体上。制作长链ssDNA做为同源重组模板。将FUS agRNA，cas9，ssDNA共转染hela和hct116细胞，通过细胞同源重组修复途径，实现报告基因GFP的敲入，嘌呤霉素筛选阳性细胞，流式分选纯化和富集带有绿色荧光的细胞，建立表达FUS-GFP融合蛋白的细胞系。结果：成功构建了带有FUS 5'arm + puro-T2A-GFP+ FUS 3'arm的靶向载体质粒。琼脂糖凝胶显示ssDNA的成功产生。共聚焦显微镜显示转染后药筛48小时的hela和hct116细胞均出现绿色荧光。流式分选显示，带有绿色荧光的细胞比例约为30%-40%。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功构建了FUS-GFP荧光报告细胞系。

    【关键词】 CRISPR/Cas9；knock in；同源重组；ssDNA；FUS

    【中图分类号】R365 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019(2018)24-001-01

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