注射用别嘌醇钠含量及有关物质分析方法的建立(2)
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参见附件(2110KB，3页)。
2.2.10 样品有关物质与含量测定
2.2.10.1 有关物质 色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相A为0.125%磷酸二氢钾; 流动相B为甲醇;流速为1.0ml/min; 检测波长为230nm。理论板数按别嘌醇计应不低于2000。
时间(分钟)流动相A(%)流动相B(%)
0928
59010
407030
测定法 取本品适量(约相当于别嘌醇50 mg),精密称定,置100ml量瓶中,加磷酸二氢钾-甲醇液(0.125%磷酸二氢钾-甲醇(80:20))溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中,加磷酸二氢钾-甲醇液稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。精密量取对照溶液20l注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20～25%;再精密量取供试品溶液和对照溶液各20l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍(1.5%)。
2.2.10.2 含量测定 色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 以0.125%磷酸二氢钾-甲醇(95:5)为流动相;检测波长为230nm。理论板数按别嘌醇计应不低于2000。
测定法 取装量差异项下的内容物,精密称取适量(约相当于别嘌醇20mg),用流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.08mg的溶液,作为供试品溶液。精密量取20l注入液相色谱仪,记录色谱图;另取别嘌醇对照品适量,精密称定,加0.1mol/L NaOH溶液5ml,振摇使其溶解,加流动相定量稀释制成每1ml中约含别嘌醇0.08mg的溶液,同法测定。按外标法以峰面积计算,即得。
表1 注射用别嘌醇钠测定结果
批 号含量(%)有关物质(%)
2004050199.90.30
20040502100.40.28
2004050398.60.30
3 讨论
3.1 有关物质HPLC色谱条件的确定
参照英国药典(BP2002,75-76页)中别嘌醇原料中有A、B、C、D、E五种杂质,极性大小分布范围分布较宽,杂质A、B、C和别嘌醇的结构类似,极性近似,保留行为相近,而杂质D、E的极性较小,实验证明,等度洗脱时杂质A、B、C与别嘌醇得到有效分离后,杂质D、E在80分钟时仍未出峰,保留时间过长。
根据以上实验结果并参照英国药典(BP2002)中别嘌醇原料有关物质采用梯度HPLC法测定。固定相为十八烷基硅烷键合硅胶,梯度线性洗脱,条件为:
时间(min)030
0.125%磷酸二氢钾(%)9070
甲醇(%)1030
参照上述方法,同时考虑到原料为国产药,可能与国外药品存在差异,所以分别以C8和C18柱为固定相,同时在不同的梯度洗脱条件下,通过比较杂质间的分离度,选择了最佳洗脱条件。
洗脱条件的选择
流动相A为0.125%磷酸二氢钾; 流动相B为甲醇
系统1:
时间(min)流动相A(%)流动相B(%)
09010
307030
系统2:
时间(min)流动相A(%)流动相B(%)
0928
59010
407030
表2 色谱条件筛选情况
色谱固定相色谱流动相检测结果
C8柱系统1别嘌醇保留时间为4min左右,且与杂质不能分离
系统2杂质A的保留时间为3.867分,B为4.808分,C为4.983分,别嘌醇为6.633分,D为26.192分,E为27.183分,且别嘌醇与C的分离度大于1.5,满足测定要求
C18柱系统1别嘌醇保留时间为4min左右,且与杂质不能分离
系统2杂质A的保留时间为3.608分,B为4.958分,C为5.158分,别嘌醇为6.642分,D为21.167分,E为22.792分,且别嘌醇与C的分离度大于1.5,满足测定要求
分别采用系统1、系统2和色谱柱C8、C18柱,经考察别嘌醇的保留行为相似,两种柱子均可使药物与杂质得到良好的分离,仅杂质D、E在C8柱中相对于C18的保留时间较长,又考虑至C18柱子的应用较广泛,所以本实验中采用十八烷基硅烷键合硅胶作为固定相,系统2作为本实验有关物质的洗脱条件。
3.1.2 含量测定HPLC色谱条件的确定参照欧洲药典(4 ......
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