模拟睡眠呼吸暂停缺氧/再氧合对小鼠肾脏组织结构的影响(2)
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1.2实验动物分组雄性ICR小鼠20只，随机分为实验组(慢性缺氧/再氧合)10只、对照组10只。每日9时至17时实验组小鼠置于缺氧箱中经历反复的缺氧/再氧合，17时以后使小鼠生活于大气环境中；对照组与实验组环境相似，不同的是所有吹入气体均为空气。实验过程30天。
1.3模拟睡眠呼吸暂停缺氧/再氧合动物模型制作在氧浓度测量仪的监测下，通过控制程序及设定各种气体的吹入时间及流量，调控箱内氧浓度。使得每一间断性缺氧循环时间为120秒，其中各种气体吹入时间顺序为：氮气30秒-静息30秒-氧气5秒-空气55秒。
1.4光镜检查20只小鼠肾脏标本置10%甲醛溶液中固定24h后石蜡包埋，按常规制成4 厚石蜡切片，HE染色观察肾脏组织结构。
1.5透射电镜检查实验结束后所有20只小鼠均在30秒内顺利取得肾脏标本，并将厚度不超过1mm的肾皮质标本置入电镜保存液。按常规方法进行前固定—漂洗—后固定—漂洗—脱水—浸透—聚合，80nm超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅各染色5分钟。水洗后在日立 Hu-12A型透射电镜下观察肾皮质超微结构的改变。
1.6统计学方法肾各种超微结构改变的阳性率的比较采用Fisher精确概率法，由SPSS统计软件完成，p<0.05有统计学意义。
2结 果
1.1肾脏大体标本实验组与对照组肾脏颜色及形态无区别。
1.2肾脏组织光镜下改变HE染色显示，正常对照组小鼠肾脏未见明显病理改变，CIH组8/10可见肾小管上皮细胞肿胀、空泡、颗粒变性，主要表现为近曲小管的病理改变(p<0.0001)，3/10出现肾小管坏死(图一， p=0.325)。
1.3肾脏组织电镜下超微结构改变对照组肾小球及肾小管上皮细胞均未见任何异常超微结构改变。实验组所有10例均有不同程度的肾小球上皮细胞足突融合、电子密度增加(图二，与对照组比较p<0.0001)； 8/10的实验组可见不同程度的系膜区增宽(p<0.0001)； 5/10有系膜细胞及基质增生(图三)； 8/10实验组小鼠发现肾小管上皮水肿，呈细胞电子密度下降改变(p<0.0001)。同时9/10实验组小鼠见肾小管上皮细胞次级溶酶体明显增多(图四， p<0.0001)。
3讨论
Iliescu [3]等研究发现，SAS患者出现蛋白尿与夜间低血氧有关，而与呼吸事件无相关性，提示CIH可能是导致SAS肾损害的主要原因。为此，本实验通过CIH动物模型研究CIH对肾脏组织结构的影响，探索SAS引起肾损害的可能机制。
大量临床实验研究发现SAS引起的肾功能损害主要为肾小管功能的受损。文献报道，急性低压缺氧可导致近曲小管颗粒变性，上皮细胞肿胀。杨永红[4]等观察：缺氧复氧诱导肾小管细胞内氧化应激的产生，诱导肾小管上皮细胞凋亡和死亡；本研究发现CIH使几乎所有实验组小鼠均表现肾小管上皮水肿，次级溶酶体增多等病理变化，同时CIH组光镜下组织学变化主要表现为近曲小管上皮细胞肿胀，空泡、颗粒变性，部分出现肾小管坏死，这与杨永红等的发现较为一致。考虑本研究中次级溶酶体增多的原因之一是CHI使肾小管上皮细胞内细胞器受损，初级溶酶体与细胞器受损后的膜片等结构相融合而形成的。同时根据张春燕[5]等的研究结果提示缺氧复氧诱导人肾小管上皮细胞蛋白质异常表达，这也可能是初级溶酶体吞噬或胞饮异常蛋白质形成了大量的次级溶酶体而导致次级溶酶体增多的另一原因。这可能导致溶酶体对蛋白分解能力减退。本实验结果为SAS主要导致肾小管损伤做出了合理的病理学解释。考虑导致这一结果的主要原因是肾小管的血液供应主要来源于肾小球，对缺血缺氧更为敏感，故肾小管病变先于肾小球，严重者表现为肾小管萎缩，间质纤维化[6]。因此，SAS患者在疾病早期有效改善低氧血症，避免肾小管进一步损伤是改善该病预后的重要环节。
与众多研究不同的是本实验还发现实验组所有小鼠肾小球上皮足突均见融合现象，这是引起低分子蛋白质从肾小球滤过增加的病理基础，故尔考虑这可能与SAS蛋白尿的发生也密切相关。有研究显示[7]早期糖尿大鼠中近曲小管上皮细胞对蛋白重吸收显著减少；更进一步的研究发现[8]“肾小球后溶酶体对蛋白分解能力减退”在高血压合并蛋白尿的发生过程中扮演不可忽视的作用。结合上述文献及本实验结果，推测SAS可能通过以下两种机制引起蛋白尿：其一，肾小球基底膜破坏使得蛋白质滤过增加；其二，肾小管溶酶体蛋白质分解能力减退或肾小管上皮对蛋白质重吸收减少。
综上所述： CIH可引起小鼠肾小管变性、坏死等病理改变，主要表现在近曲小管，模拟SAS慢性缺氧/再氧合可引起肾小球上皮细胞足突融合、肾小管上皮次级溶酶体增多等，这在SAS肾并发症的发生与发展过程中起重要作用。
图一实验组HE染色结果，肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性、颗粒变性，可见部分肾小管坏死。
图二肾小球上皮细胞足突融合、电子密度增加
图三系膜细胞及基质增生
图四 肾小管上皮细胞次级溶酶体增加
参考文献
[1] 陈晓阳，曾奕明，黄子扬，等.慢性间断缺氧小鼠缺氧诱导因子1α的研究. 中华结核和呼吸杂志,2005,28(2):93-96.
[2] 宋爱玲，曾奕明，陈晓阳，等.慢性缺氧/再氧合小鼠模型实验研究. 国际呼吸杂志,2006,26(6):408-411.
[3] Iliescu EA, Lam M, Pater J, Munt PW. Do patients with obstructive sleep apnea have clinically significant proteinuria? Clin Nephrol, 2001,55(3):196-204 ......
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