CTE-RHA复合核酶抑制HCVRNA复制的研究(2)
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3 讨论
丙型肝炎病毒是肝炎病毒家族的重要成员之一，是引起病毒性非甲非乙肝炎和输血后肝炎的重要病原体，目前尚无非常有效的治疗方法。70%以上的感染者将发展成为慢性感染，部分将发展成肝硬化或肝癌。目前干扰素或干扰素联合病毒唑是治疗HCV感染的主要治疗手段，但仅30%左右病人有效。据WHO报告，世界上丙肝病毒感染者约1.7亿人，我国感染丙肝人数约在4000万以上(2003)，危害极大。
HCV基因组全长9.5kb，由编码区和5′末端及3′末端两个非编码区构成[1]。其中，NS5区最长，有3150个核苷酸，编码病毒的RNA依赖的RNA多聚酶，参与病毒复制[4]。NS5区分为NS5A和NS5B两区，NS5A区生物功能最为活跃，是目前的一个研究热点。NS5A基因具有多种生物学功能，参与多种蛋白的成熟和复制过程、细胞调控、病毒基因表达、细胞生长、凋亡以及免疫调节过程，还具有反式激活作用、预测干扰素疗效的作用。核酶是一类能对特定序列的RNA进行切割、具有催化功能的小RNA分子。Macejak DG[2]等针对HCV5′-非编码区15个保守序列位点设计核酶，并采用修饰基团进行修饰以延长核酶的半衰期、增加核酶的稳定性。研究发现：数个核酶可明显抑制HCV的复制，用针对195位点的核酶进一步研究显示抑制效应呈剂量依赖性，并具有序列特异性。
核酶的作用实际上受很多因素的影响[5]。其中，底物RNA的空间构型成为目前影响普通核酶在细胞内发挥作用的最为关键和最难控制的因素。Kuwabara T[6]等研究发现tRNA-核酶在胞浆的活性显著高于在胞核时的活性。Warashina M等[3]报道将核酶联接到D型逆转录病毒的胞浆转运信号序列CTE后，由于CTE具有RHA的结合序列，RHA能与CTE结合，使核酶能到达任何需要切割的位点。他们通过对结构复杂的HIV TAR基因RNA的研究发现，普通核酶不能切割的位点，带CTE-核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，带CTE-核酶的切割效率比普通核酶明显提高。另外，CTE含有的胞浆转运信号能使核酶自由地由细胞核转运至细胞浆，使核酶能有效地与分布于细胞浆的底物RNA接触，进一步提高核酶的使用效率。
本实验根据Macejak DG等[2]的报告，1b型丙型肝炎病毒cDNA5-NCR序列的195位点是核酶最易切割的位点。根据Ali N[7]报告的HCV 5-NCR二级结构推测150位点是核酶最难到达的位点，分别根据这两个位点的序列设计选择已构建的普通核酶和带有CTE的新型核酶，针对195位点的普通核酶pPHCV5-R1和新型复合核酶pPHCV5-CR1以及针对150位点的新型复合核酶pPHCV5-CR2均可在细胞内有效切割HCV 5-NCR序列。针对150位点的普通核酶pPHCV5-R2不能有效切割目标RNA，这可能是由于RNA的二级结构掩盖pPHCV5-R2核酶的切割位点(150位点)致使pPHCV5-R2核酶无法完成切割。结果还显示新型复合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2的切割效率均高于相对应的普通核酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2，这可能与CTE具有解旋酶A(RHA)的结合序列，与RHA结合后，使核酶能到达任何需要切割的位点，从而提高了核酶的切割效率有关，研究结果与Warashina M等人的结论一致。新型核酶在细胞内的切割靶RNA的效率明显高于普通核酶。普通核酶难以切割的位点，CTE介导的核酶能进行有效的切割；普通核酶能进行切割的位点，CTE介导的核酶的切割效率明显提高。为核酶在抑制HCV的研究领域中提供新的思路和方向。
参考文献
[1] Choo QL, KH Richman, JH Han, et al. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88:2451-2455.
[2]Macejak DG, Jensen KL, Jamison SF,et al. Inhibition of hepatitis C virus (HCV)-RNA-dependent translation and replication of a chimeric HCV poliovirus using synthetic stabilized ribozymes. Hepatology. 2000,3;31(3):769-776.
[3]Warashina M, Kuwabara T, Kato Y,et al. RNA-protein hybrid ribozymes that efficiently cleave any mRNA independently of the structure of the target RNA ......
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