大肠癌c-erbB-2基因扩增的荧光原位杂交检测
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【摘要】目的 研究c-erbB-2基因扩增。方法 使用荧光原位杂交技术(FISH)检测55例。结果 肿瘤区c-erbB-2基因扩增阳性率为36.4%。在移行区内阳性率为10.9%，在正常粘膜区阳性率为3.6%，相互比较，三个区域之间差异有高度显著性(P<0.01)。在高与低分化组，c-erbB-2基因扩增阳性率为52.2%和15.8%，两者差异有显著性(P<0.05)。c-erbB-2基因扩增阳性与淋巴结内转移有明显相关性(P<0.05)。结论 c-erbB-2基因扩增与的发生，发展有明显关联，有助于判断预后。
【关键词】大肠肿瘤 原癌基因 c-erbB-2 原位杂交 荧光
中图分类号：R739.65 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)4-374-02
荧光原位杂交技术(fluorscence in situ hybridization, FISH)曾用于细胞遗传学染色体的分析[1]，近年被用于肿瘤基因分析研究[2，3]。我们应用FISH技术检测和癌旁组织c-erbB-2基因表达情况，并分析其与的发生、分类、分级和淋巴结转移的关系。
1 材料和方法
1.1 材料与方法
病理标本与临床资料。1998年2月～1999年4月秦皇岛市第一医院普外科手术切除的55例标本,均经病理证实。男31例,女24例。年龄27～84岁，平均55.6岁。术前均未化疗。每例标本按肿瘤区，移行区(距肿瘤边缘0.5～1 cm)和正常区取材，10%福尔马林固定，常规脱水包埋，切片厚4 μm，HE染色。按癌组织分化程度分为:高分化组14例,中分化组26例,低分化组15例。按癌组织浸润肠壁深度分为:T1(浸润至粘膜及粘膜下层)5例,T2(浸润至肌层)20例,T3(浸润至浆膜和浆膜外)30例。临床分期: Dukes A期5例, Dukes B期18例， Dukes C期28例 Dukes D期4例，均有完整随访资料。
1.2 试 剂
c-erbB-2生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂配制：(1)20×SSC：88.2 g枸椽酸钠，173.3 g NaCl加水至1 000 ml，高压灭菌。(2)变性液：28 ml去离子甲酰胺，4 ml 20×SSC，8 ml蒸馏水。(3)PBD液：用下列液代替，1 000 ml 20×SSC， 加1.25 g Tween 20，相当于5×PBD。
1.3 FISH
切片厚<4 μm，置于硅烷玻片上60℃过夜。脱蜡至80%乙醇，晾干：2×SSC洗，5 min×3次；0.2 mol.L-1盐酸10 min；2×SSC， 5 min×3次；250 mg.L-1蛋白酶K室温30 min；2×SSC洗，5 min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8 min后快速入-20℃ 70%～100%乙醇脱水，各2 min，晾干；同时将配好的含有c-erbB-2探针的杂交液85℃变性5 min，然后放在0℃冰浴10 min；滴加探针杂交液，每片15～20 μl，用盖片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，加入50%甲酰胺，45℃，10 min；入2×SSC，40℃，5 min；入2×SSC，37℃，5 min；PBD室温 2 min；每片滴加15～20 μl FITC标记的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃，30 min；PBD 2 min×3次;滴加15～20 μl生物素结合的Avidin，加盖塑料膜，湿盒37℃，30 min；PBD 2 min×3次；再加15～20 μl FITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒37℃， 30 min；PBD 2min×3次；滴加PI/Antifade，每片20 μl(避光)，直接封片，5 min后，荧光镜检。
1.4 对照
①正常大肠粘膜组织；②用2×SSC代替探针杂交液作对照。
1.5 观察
用Olympus BX60荧光显微镜观察(滤镜WB，激发波长490～600 nm)。判断结果：癌细胞核中有4个以上斑点状黄绿色荧光则说明该基因有扩增，定为阳性。
1.6 统计学处理
率的比较用x2检验。
2 结果
2.1 阳性细胞成群分布，在中荧光信号增强
2.2 c-erbB-2基因扩增
在55例区域分布中，肿瘤区内c-erbB-2基因扩增20例，阳性率36.4%；移行区内扩增6例，阳性率10.9%；正常区内，扩增2例，阳性率3.6%，在三个区域中分别比较，P<0.01或P<0.001，差异有非常显著性。c-erbB-2基因扩增与组织分化程度和淋巴结转移的关系见附表：在分化程度上，c-erbB-2基因扩增阳性在各级之间分别比较，仅见1级与3级之间有显著性(P<0.05)。在逐级比较中，差异无显著性(P>0.05)。在与淋巴结转移的关系中，转移癌c-erbB-2阳性17例(48.6%)，无转移者阳性3例(15%)，相互比较(P<0.05)有统计学意义。
表1 c-erbB-2基因扩增与组织分类、分级和淋巴结转移的关系
3 讨 论
国外学者应用免疫组化等方法研究组织中c-erbB-2蛋白的表达[4～6]，以此间接反映c-erbB-2基因的激活，其结果不尽相同。我们采用FISH技术检测c-erbB-2基因扩增，其原理与其Southern印迹杂交相同，以变性的DNA单链作为模板，用另一DNA探针与其碱基互补生成杂交复合体发出荧光。该探针带有生物素荧光标记作为阳性反应，可用于细胞和组织切片，说明有关核酸序列的位置状况及染色体中特定基因的位置[7，8]。同其他分子生物学技术比较，FISH避免了肿瘤内非实质性细胞对实验结果的干扰。不仅能对阳性信号直接做出较准确的定位，还能对阳性信号作出定量分析[9]。c-erbB-2基因是位于17号染色体上的原位基因，c-erbB-2基因的激活或扩增与的发生关系密切[5，6]。本实验用FISH检测肿瘤区内c-erbB-2基因表达阳性率为36.6%，表明c-erbB-2基因的扩增与激活，使得大肠上皮细胞生长、分化的调控发生了改变，因此在的发生上起着重要作用。本组检测发现的移行区，正常粘膜区c-erbB-2基因扩增阳性率分别为10.9%和3.6%，反映了c-erbB-2基因激活在癌变过程中起动较早，提示代表癌前病变或大肠粘膜上皮细胞的高度增殖状态，可能对癌前病变的研究有一定意义。
本组结果还发现在c-erbB-2基因扩增阳性与大肠癌分化程度的关系中，仅见高、低分化癌之间有明显差异(P<0.05)，但在逐级比较中差异无显著性(P>0.05)，表明c-erbB-2基因扩增与癌的分化高低有关，但不能作为分级的参数。在分析与淋巴结转移的关系中，c-erbB-2基因扩增阳性与淋巴结转移呈正相关，对预后有一定意义。
参考文献
[1]Hou JW, Liu Ch, Wang TR et al. Mosaic ring chromosome 13 analyzed by fluorescence in situ hybridization ......
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