检测组织工程构建真皮替代物中分泌细胞外基质和生长因子的相关实验研究
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【摘要】目的 通过将真皮成纤维细胞接种PGA(polyglycolicacid)支架材料，检测细胞材料复合物分泌细胞外基质情况和分泌生长因子情况。方法 小儿包皮真皮中分离的成纤维细胞，进行传代扩增，将成纤维细胞接种PGA支架材料上。通过羟脯氨酸测试法和阿利新蓝染色法分别检测细胞材料复合物中分泌细胞外基质胶原和葡糖胺基聚糖(GAG)含量。通过ELISA方法检测细胞材料复合物分泌生长因子TGF-β1、VEGF和bFGF的含量。结果 细胞材料复合物的细胞外基质分泌表达检测见GAG及胶原含量随着时间逐渐增加。可检测到细胞分泌生长因子TGF-β1及VEGF，但未能检测到bFGF。结论 成纤维细胞在PGA材料上生长，能够分泌合成细胞外基质如GAG及胶原，并能分泌生长因子TGF-β1和VEGF。
【关键词】组织工程 真皮 细胞外基质 生长因子
中图分类号：R318.08 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)10-356-02
随着生活水平提高，糖尿病发病率逐年增高，糖尿病皮肤溃疡为糖尿病常见并发症之一，具有创面难愈合性，严重的影响病人的生存质量，目前常规的治疗并不能取得令人满意的治疗效果[1]。近年来，组织工程学取得了长足发展，使糖尿病皮肤溃疡的治疗方法有了新的选择。创面愈合过程是一系列连续但相重叠的阶段，愈合过程是通过不同类型的细胞有序的迁移入创面来完成的。糖尿病患者皮肤创面炎性细胞分泌细胞因子减少，成纤维细胞发生凋亡病变，抑制创面愈合过程[2]。本实验中，应用真皮成纤维细胞作为组织工程种子细胞，应用PGA支架材料作为组织工程支架材料，构建成真皮替代物，进行检测细胞材料复合物分泌细胞外基质情况和分泌生长因子情况。
1 材料与方法
1.1 主要实验仪器和试剂 扫描电子显微镜(Hitachi，日本)。中性蛋白酶(Electrophoresis GmbH公司，德国)；NB4 胶原酶(Electrophoresis GmbH公司，德国)； ELISA试剂盒(R&D公司，美国)；全波长荧光/比色扫描读数仪 (Thermo公司，美国)。
1.2 细胞分离、培养和扩增 将儿童包皮环切术术后包皮剪刀剪去皮下脂肪组织，表皮面朝下浸于中性蛋白酶液中， 37℃下消化2～4小时。用眼科镊将表皮与真皮分离开。将分离的真皮组织充分剪碎，加入0.2%NB4胶原酶溶液30ml，在37℃恒温摇床消化3小时。以5×104/cm2细胞密度接种于培养皿内，加入培养液10ml。每3天换一次液，细胞融合至80%即传代。
1.3 总胶原含量的测定
取25块10mg、5×10mm2大小、8mm厚度的PGA材料接种20million/ml 的成纤维细胞悬液，接种液体量为50μl。细胞材料复合物在高糖DMEM培养液中培养。第5、9、13、17和21天分别取5块材料进行检测。用羟脯氨酸测试法检测。根据羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%，进一步计算样本中胶原的含量。
1.4 葡糖胺基聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)含量的测定
取25块10mg、5×10mm2大小、8mm厚度的PGA材料接种20million/ml 的成纤维细胞悬液，接种液体量为50μl。细胞材料复合物在高糖DMEM培养液中培养。在第5、9、13、17和21天分别取5块材料进行检测。用阿利新蓝染色法计算样本内GAG的含量。
1.4 分泌生长因子含量的测定
取4块20mg、10×10mm2大小、8mm厚度的PGA材料接种20million/ml 的成纤维细胞悬液，接种液体量为160μl。细胞材料复合物在高糖DMEM培养液中培养。放入24孔板中，加入DMEM培养液中1.5ml。每隔2天换一次液。分别于第5天、第9天、第13天、第17天和第21天取上清液，放置于EP管中，置于-80℃中保存。用ELISA方法检测VEGF、TGF-β1和bFGF分泌量。
2 结果
2.1 总胶原含量的检测
成纤维细胞/PGA支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌细胞外基质。对其总胶原含量的检测表明，细胞材料复合物随时间增加，总胶原含量逐渐增加。见图1：
2.2 GAG定量检测
成纤维细胞/PGA支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌细胞外基质。对其GAG含量的检测表明，细胞材料复合物随时间增加，GAG含量逐渐增加。见图2：
2.3 泌生长因子含量的测定
成纤维细胞/PGA支架材料复合物在培养液中培养，成纤维细胞合成分泌生长因子VEGF和TGF-β1。应用ELISA方法检测，VEGF生长因子分泌量以13天分泌量最高，对照组培养液中并不含VEGF。TGF-β1生长因子分泌从第5日到第9日下降，然后又逐渐增高，第17日为峰值。而对照组培养液TGF-β1中含量保持稳定。与此相对应的，应用ELISA检测方法，我们发现在实验组和对照组中培养液中，均未能检测出有分泌bFGF。见图3，图4：
附图：
图1：
图2：
图3：
图4：
TGF-β1分泌量
图1：细胞材料复合物在体外培养进行总胶原含量测定
图2：fibroblasts/PGA细胞材料复合物在体外培养进行GAG含量测定
图3： fibroblasts/PGA细胞材料复合物在体外培养进行分泌VEGF含量测定。
图4：fibroblasts/PGA细胞材料复合物在体外培养进行分泌TGF-β1含量测定。
3 讨论
在真皮脱细胞基质中，主要成分为胶原和GAG，胶原占了细胞外基质的大部分成分，而GAG占细胞外基质的相对小部分，但是在创面愈合中GAG其具有促进细胞外基质形成和胶原有序沉积作用[3]。因此我们对成纤维细胞/PGA复合物进行测量总胶原含量及GAG含量。定量测试结果表明，细胞材料复合物在培养过程中，随时间增长，总胶原含量呈上升趋势，GAG含量亦呈上升趋势，但合成的细胞外基质中总胶原含量比GAG含量要高。实验表明，成纤维细胞在PGA材料上生长具有合成胶原及GAG等细胞外基质能力。
各种生长因子在创面愈合过程中起到了一个关键的核心作用[4]。其中TGF-β1在创面愈合中起到了一个中心环节的作用[5]。我们对培养中的细胞材料复合物进行检测分泌生长因子，VEGF和TGF-β1。其中VEGF在第13天时分泌量最高，且细胞培养液中不含有VEGF。而含10%胎牛血清的高糖DMEM的细胞培养液中虽含有一定量的TGF-β1，但我们检测发现其含量值始终保持稳定，TGF-β1测定稳定在700pg/ml。我们对其检测观察，实验组 TGF-β1在第17天达到峰值。其中VEGF和TGF-β1均存在第5天到第9天分泌量下降，然后逐渐增高趋势，其中VEGF在第13天达峰值，而TGF-β1在第17天达到峰值，然后都出现逐渐下降趋势，可以看出VEGF和TGF-β1分泌曲线有一定的相似性。
我们通过检测细胞材料复合物分泌细胞外基质和分泌生长因子证实 ......
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