PAI-1基因(CA)n微卫星多态性与多囊卵巢综合征孕早期自然流产的相关性研究(1)
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【摘要】目的 探讨纤溶酶原激活物抑制物-1( plasminongen activator inhibitor 1, PAI-1)基因内含子4中(CA)n二核苷酸重复序列微卫星多态性及其血清水平与辽宁省汉族多囊卵巢综合征(PCOS)孕早期自然流产的关联性。方法 我们研究了107名健康对照组和142名PCOS患者，后者被分为两组：83名患者有过两次或两次以上自然流产史，59名患者没有自然流产史或未怀孕。获得的基因组DNA进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。ELISA法检测PAI-1抗原活性，所有相关临床特征均被检测。结果 共检测出PAI-1基因(CA)n二核苷酸重复序列基因型12种，CA拷贝数在18～29之间；PCOS自然流产组CA拷贝数N≤21的例数明显高于正常对照组(P<0.001)和PCOS非自然流产组(P<0.05)；而PCOS非自然流产组与正常对照组间基因型差异无显著性(P>0.05)；CA拷贝数越少，PAI-1活性越高；PAI-1活性与快速胰岛素、血糖水平均值呈正相关关系。结论 PAI-1基因内含子4中(CA)n微卫星多态性可促进PAI-1活性增高，可能与PCOS患者孕早期自然流产率高有关，胰岛素和血糖可能对PAI-1基因表达起调节作用。
【关键词】纤溶酶原激活物抑制物-1 多囊卵巢综合征 基因多态 短串联重复
中图分类号：R711.75文献标识码：B文章编号：1005-0515(2011)11-142-03
多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)是育龄妇女最常见的内分泌紊乱性疾病，发病率约为5%～10%，有学者报道高达20%[1]，我国最新调查报告群体患病率约为6.46%[2]。PCOS最明显的特征为月经过少和无排卵性不孕，且妊娠后孕早期自然流产率高达30%～50% [3]。血浆纤溶酶原激活物抑制因子1(plasminongen activator inhibitor 1, PAI-1)活性及水平升高，是PCOS患者存在纤溶系统失调的重要标志也是其发生远期并发症的重要因素，血栓形成倾向、纤溶能力下降和PCOS均与自发性和再发性流产有关。低纤溶是PCOS患者流产的一个重要原因，PA1-1的活性与PCOS患者流产率呈正相关。PAI-1可以变更迁移和侵袭绒毛滋养层细胞，并可以防止在胎盘形成时的额外出血。PAI-1基因有8处不同的多态位点，其中存在于第4内含子内的(CA)n二核苷酸重复序列多态性与PAI-1活性有关，这可能对PCOS的发病，尤其是对PCOS患者孕早期自然流产起一定的作用。在中国人群中尚未见类似研究报道。本研究旨在基因水平探讨PAI-1基因第4内含子(CA)n微卫星多态性与中国汉族多囊卵巢综合征患者及其孕早期自然流产发生率高的相互关系。
1 资料与方法
1.1 资料来源及诊断标准
所有参与研究的PCOS患者均于2010年3月—2010年12月就诊于大连市妇产医院生殖医学中心，142名患者被分为两组：83名患者有过两次或两次以上自然流产史，59名患者没有自然流产史或未怀孕。107例健康对照组来自同一地区，月经正常(3-7/28-35天)，雄性激素水平正常，平均年龄为(26.13±2.67)岁。两组研究对象均为无亲缘关系的汉族人。
PCOS患者的诊断按照2003年10月美国生殖医学学会于荷兰鹿特丹会议上修订的PCOS诊断标准为依据：排卵减少或无排卵；临床或生化高雄激素表现；阴道超声每侧卵巢内直径2mm～9 mm的卵泡≥12个或卵巢体积10 cm以上；具有以上三项中两项或以上，并排除了先天性肾上腺皮质增生、雄激素分泌肿瘤及库欣病等疾病。
参与研究的人群均没有急慢性疾病，在受试之前三个月就停止服用口服避孕药或其他影响性激素水平的药物，体重身高比较稳定至少在两个月内。我们检测体重指数(BMI)来估计是否肥胖，腰臀比(WHR)来估计脂肪分布情况。所有人外周血的采取均在卵泡期，即月经期或孕酮撤退后出血2-5天，空腹、卧位采集肘静脉血，外周血的采取用于DNA分析，血清总雄激素T、卵泡雌激素FSH、黄体生成素LH、快速胰岛素和快速血糖水平均被检测。血样均用枸橼酸钠抗凝，常规保存。新鲜血液离心后所取得的血清储存于-20℃ 用于PAI-1活性检测。本研究经大连市伦理学会批准，并有受试者书面同意书。
1.2 方法
1.2.1 生殖激素、胰岛素及PAI-1活性等测定：黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH )、睾酮(T)等生殖激素及快速胰岛素测定，采用增强化学发光法(化学发光仪为美国Beckman Access Health公司产品)，进行同批试剂盒测定。快速血糖测定采用葡萄糖氧化酶法测定。体重指数BMI为体重(kg)/身高(m2)，腰臀比WHR为腰围(cm)/臀围(cm)。采用ELISA法测定血浆PAI-1活性(试剂盒购于DR Lab, California, USA)。
1.2.2 基因组DNA提取及PCR检测：采用蛋白酶K消化，标准饱和酚-氯仿法抽提白细胞中基因组DNA。引物设计由上海生物工程有限公司合成，引物序列为5’-ATT TGA ACC GGA TTC GGA GGC TGC-3’和5’-CCC CTG TTC ACT GCT CCC CTA TTC-3’。50μl反应体系中模板DNA 1μg，引物各0.6μmol/L，dNTP各50μmol/L，TaqDNA聚合酶3.0 U，10×Buffer 5μ1。扩增条件为：94℃5min预变性后94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，循环32次，充分延伸5min，4℃保存10min。以PBR322DNA/Msp1作为分子量参照物，2%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色鉴定PCR扩增情况。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶检测(CA)n微卫星多态性：取PCR扩增产物10μ1加入甲酰胺，95℃高温变性后，8%变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(恒压200V, 4小时) ......
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