依诺肝素钠中残留苄索氯铵限度检测方法的建立

http://www.100md.com 2011年11月1日 吴建兵 徐龙军 周金宝 郑裕国

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     【摘要】目的 建立依诺肝素钠中残留苄索氯铵限度检测方法。方法 采用高效液相等度洗脱法，色谱柱：Phenomenex LUNA C18(2) (250×4.6 mm， 5um)，流动相为甲醇：水=90：10(含高氯酸钠0.1M并用磷酸调pH至3.0)，流速1.0ml/min,波长215nm,柱温：25℃。结果 苄索氯铵在4.7min左右出峰，可与依诺肝素钠完全基线分离，检测限为5ng。结论 该方法快速、实用，可用于依诺肝素钠成品质量控制的检测方法。

    【关键词】依诺肝素钠 残留苄索氯铵限度检测 高效液相等度洗脱

    中图分类号：R446.14文献标识码：B文章编号：1005-0515(2011)11-358-02

    The Establishment ofResidual Benzethonium Chloride’s Limitation in Enoxaparin Sodium

    WU Jianbing1,2，XU Longjun1，ZHOU Jinbao1，ZHENG Yuguo2

    (1.Hangzhou Jiuyuan gene engineering co.,Ltd,Hangzhou,310018;2.Zhejiang University of Technology,Hangzhou,310014)

    【ABSTRACT】OBJECTIVE To establish a suitable method for limitation of residual Benzethonium Chloride in Enoxaparin Sodium。METHODS Using HPLC isocratic elution。Mobile phase, methanol-water(9:1,v/v)containing 0.1M sodium perchlorate, the pH was adjusted to 3.0 by addition of phosphoric acid; Column, Phenomenex LUNA C18(2) (250×4.6 mm， 5um); Flow rate,1.0ml/min; The temperature was 25℃ and the detector was set at 215nm.RESULTS Benzethonium Chloride’s retention time was about 4.7min, can be absolutely separated. The LOD was 5ng.CONCLUSION The method is rapid and simple, rensults are accurate ，can be used in quality control of Enoxaparin Sodium.

    【Key word】enoxaparin sodium，residual benzethonium chloride’s limitation，HPLC isocratic elution

    依诺肝素钠是一种低分子肝素钠盐，为多组分物质[1]。以猪粘膜肝素为起始原料，经肝素季铵盐制备、肝素苄酯的制备、对肝素苄酯进行碱解聚、以酸中和、醇沉淀，精制、脱色，脱水干燥，得到依诺肝素钠成品[2]。在依诺肝素钠的制备过程中添加苄索氯铵，在成品质量控制中应当对其残留进行限度检测，但目前未见文献报道依诺肝素钠中残留苄索氯铵限度检测的方法[3-4]。本文通过试验，采用高效液相等度洗脱法试图建立依诺肝素钠中残留苄索氯铵的限度(0.1%)检测方法。

    1 仪器与材料

    1.1 仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司),G1314B VWD紫外检测器，G1329A ALS自动进样器，G1316A TCC柱温箱。

    1.2 材料：依诺肝素钠(杭州九源基因工程有限公司)，批号：20090801、20100201、20110201。苄索氯铵(美国LONZA公司)，批号：9A0534。

    2 方法与结果

    2.1 色谱条件

    色谱柱：Phenomenex LUNA C18(2) (250×4.6 mm 5um, 100 ,P/N：00G-4252-E0)。

    流动相：甲醇：水=90：10，同时含高氯酸钠0.1M并用磷酸调pH至3.0。

    流速：1.0ml/min。波长：215nm。进样体积：10ul。柱温：25℃。

    2.2 依诺肝素钠溶液的制备

    精密称定依诺肝素钠100mg，用水溶解，用容量瓶定容至10ml，制成10mg/ml的溶液。

    2.3 苄索氯铵溶液的制备

    精密称定苄索氯铵100mg，用水溶解，用容量瓶定容至1000ml，再稀释10倍制成10ug/ml的溶液。

    2.4 依诺肝素钠+苄索氯铵混合溶液的制备

    精密称定，稀释混合，制成终浓度含依诺肝素钠10mg/ml、苄索氯铵10ug/ml的溶液。

    2.5 精密度试验

    取2.3项下溶液，连续进样6次，结果峰面积RSD=1.2%,出峰时间RSD=0.19%，平均理论塔板数=12716。不同天不同人员重复试验，结果峰面积RSD=0.48%,出峰时间RSD=0.03%，平均理论塔板数=12498。

    2.6 专属性试验

    取空白(水)、2.2项下溶液、2.3项下溶液、2.4项下溶液，按本法色谱条件分别进样10ul，记录色谱图。结果显示空白(水)样在2.5min-4.0min之间有溶剂峰出现，依诺肝素钠为多组分物质峰型并非单一尖峰，苄索氯铵的出峰时间约为4.7min，且能与依诺肝素钠完全基线分离，分离度为5.06。见图1

    图1 高效液相色谱图

    A-空白；B-依诺肝素钠(10mg/ml)；C-苄索氯铵(10ug/ml)；D-依诺肝素钠(10mg/ml)+苄索氯铵(10ug/ml)

    Fig 1 HPLC chromatograms

    A-Blank；B- Enoxaparin sodium(10mg/ml);C- Benzethonium chloride(10ug/ml)； ......

    http://www.100md.com/html/paper/1005-0515A/2011/11/402.htm

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