血清IL-18BP水平及外周血单个核细胞IL-18BPmRNA的表达水平与HBV宫内感染的相关性研究
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【摘要】目的 通过研究HBV宫内感染组与未感染组之孕妇血清HBV含载量(HBV-DNA)、IL-18结合蛋白(IL-18BP)分泌水平及外周血单个核细胞IL-18结合蛋白RNA(IL-18BPmRNA)表达水平的差异，探讨IL-18结合蛋白、IL-18结合蛋白mRNA与HBV宫内感染的相关性及其临床意义。方法 选择2010年1月至2010年12月在我院分娩，患乙肝大三阳的单胎足月妊娠孕妇，检测其新生儿脐带血HbsAg和HBV-DNA，诊断HBV宫内感染孕妇30例作为研究组，未发生宫内感染孕妇随机抽取60例作为对照组。分别用ELISA定量法及逆转入聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测90例孕妇血清HBV-DNA、IL-18BP水平及外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平。结果 1、HBV宫内感染组孕妇外周血清HBV-DNA较未感染组孕妇显著升高，而外周血清IL-l8BP分泌水平、外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平则显著降低，两组差异有统计学意义(P<0.01)。2、血清HBV含量与IL-l8BP分泌水平及外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平均呈负相关性；外周血清IL-l8BP分泌水平与外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平呈正相关性。结论 HBV宫内感染孕妇体内HBV病毒复制活跃；HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降有关，IL-18BP是一种能够与IL-18以高亲合力特异性结合，并拮抗IL-18相关生物学功能的蛋白因子，其表达水平受IFN-γ的调节，IFN-γ上调IL-18BPmRNA的表达，IL-18、IFN-γ、IL-18BP、IL-18BPmRNA组成一个负反馈机制，IL-18BP、IL-18BPmRNA参与IL-18水平的调节，并能间接反映IL-18水平，IL-18BP、IL-18BPmRNA水平降低提示有HBV宫内感染可能。
【关键词】肝炎病毒 疾病传播/垂直 IL-18BP IL-18BPmRNA
中图分类号：R512.62 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2012)1-036-02
我国是乙型肝炎的高流行区，人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带率高达10%～20%，其中40%～50%通过母婴垂直传播。而宫内感染是母婴垂直传播的主要途径。近年研究资料证明：HBV宫内感染率为9.1%-36.7%[1]。我们的前期研究显示HBV宫内感染与孕妇外周血IL-18分泌下降有关，IL-18水平下调可能是HBV宫内感染的危险因素之一[2]。白介素-18结合蛋白(IL-18BP)是1999年确定的一种能够与IL-18以高亲合力特异性结合，并拮抗IL-18相关生物学功能的蛋白因子。本文通过检测HBV宫内感染组与未感染组孕妇血清HBV-DNA、IL-18BP水平和外周血单个核细胞(PBMC)内IL-18 mRNA的表达水平, 探讨HBV-DNA、IL-18BP、IL-18BP mRNA与HBV宫内感染的相关性及其临床意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象 选择2010年1月至2010年12月在江西省妇幼保健院完整产前检查并分娩的，患乙肝大三阳(HbsAg、HbeAg及HbcAb三项阳性)且肝功能正常，无其它妊娠并发症及合并症的单胎足月妊娠孕妇，其丈夫排除HBV携带，分娩即刻采集新生儿脐带血检测乙肝两对半和HBV-DNA，诊断HBV宫内感染孕妇30例作为研究组，未发生宫内感染孕妇随机抽取60例作为对照组。孕妇年龄、孕产次、胎龄、新生儿性别及分娩方式两组比较均无统计学差异(P>0.05)。
1.2 研究方法
1.2.1 标本采集及保存 采集患乙肝大三阳孕妇空腹外周血3管各3ml，1管用于检测HBV-DNA，2管用自动离心机3000r/min离心30min，分离血清及单个核细胞，置于去RNA酶EP管-80℃液氮中保存，等待检测IL-18BP、IL-18BPmRNA。分娩即刻采集新生儿未注射乙肝免疫球蛋白及乙肝疫苗脐带血2ml，用于测乙肝两对半及HBV-DNA。
1.2.2 检测方法 (2)新生儿血清乙肝两对半测定：采取ELISA法，试剂由中山生物工程有限公司提供，按说明书操作；(1)孕妇及新生儿血清HBV-DNA检测：用荧光定量PCR法，试剂中山大学达安基因股份有限公司提供，按说明书操作；(3)孕妇血清IL-18结合蛋白测定：试剂由北京天更生物试剂提供，所用Labsystems MK3型酶标仪及可调多道移液器(5～200uL)为芬兰Thermo Labsystems公司产品，DNX-9620电脑洗板机由北京普朗新科技有限公司生产，按说明书操作；(4)孕妇外周血单个核细胞内IL-18 mRNA测定：(i)IL-18BPmRNA提取：RNA提取试剂盒(离心柱)由北京天更生物试剂提供，按说明书操作；(ii)荧光定量PCR的操作步骤：引物设计，查IL-18BPmRNAα基因序列：NM_173042，引物设计如下：hIL-18bpF CTGGGCAATGGTTCCTTCA；hIL-18bpR CTGTTCAGGGTCCACGAGC(171bp)，引物探针由韩国 BioNeer公司提供；反转录反应条件的设置：25℃10分钟 42℃60分钟，85℃5分钟；荧光定量PCR扩增条件的设置：94℃4分钟；94℃20秒 60℃30秒 72℃30秒循环35次，72℃检测信号，荧光定量PCR试剂盒由韩国 BioNeer公司提供，严格按说明书操作。
1.3 HBV宫内感染诊断标准：新生儿脐带血HBsAg和/或HBV-DNA阳性(HBV-DNA>1.00×103拷贝/ml为阳性)。
1.4 统计学处理 应用SPSS l1.0软件分析数据，结果以(x±s)表示，用卡方检验、t检验以及spearman相关性分析进行统计学分析。
2 结果
2.1 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP水平和PBMC内IL-18BPmRNA的表达水平
HBV宫内感染组(研究组)孕妇外周血清HBV-DNA水平较未感染组(对照组)孕妇明显升高，而外周血清IL-l8BP分泌水平、外周血单个核细胞IL-l8BPmRNA表达水平则显著降低，两组差异有显著统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP和PBMC内IL-18BPmRNA水平变化(x±s)
2.2 两组病例血清HBV-DNA、IL-18BP水平和PBMC内IL-18mRNA的表达水平的相关性分析 从散点图上看 ......
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