双纸片法检测大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的临床意义
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摘要:目的通过双纸片法确证试验了解大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的发生率及其对部分抗生素耐药性分析。方法 用药敏纸片法对183株大肠埃希氏菌和124株肺炎克雷伯菌进行抗菌素的药物敏感试验,并对这2种菌用筛选试验和双纸片法确证试验确认产ESBLs菌株。结果183株大肠埃希氏菌和124株肺炎克雷伯菌中确证试验产ESBLs的阳性率分别为53.6%和47.6%。产ESBLs菌对头孢类抗生素高度耐药,对庆大霉素、环丙沙星的耐药率为43.9%～66.5%,对亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦均呈显高度的敏感(100.0%),(采用Whonet5.3软件进行统计和药敏数据分析)。 结论大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的阳性率较高,应加强这2种菌的耐药性监测,临床医生应根据药敏结果合理选用抗生素进行抗感染治疗。
关键词:超广谱β-内酰胺酶;大肠埃希氏菌;肺炎克雷伯菌。
超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)多由质粒介导,能水解包括三代头孢菌素、单环酰胺类抗生素和四代头孢菌素等含1个氧亚氨基基团侧链的β-内酰胺(oxyimino β-lactam)类抗生素[1],但可β-内酰胺酶抑制剂(克拉维酸)等抑制。随着三代头孢菌素的广泛应用,产ESBLs菌引起的耐药问题越来越严重,对临床分离产ESBLs细菌的监测成为临床微生物检验十分重要的内容,对指导临床合理选用抗生素进行有效的抗革兰氏阴性菌感染的治疗、医院内感染的控制、抑制新产生的耐药菌等均有十分重要的意义。
材料和方法
一、材料
1.菌株来源 收集我院2006年01月至2008年10月住院及门诊感染患者送检的痰、中段尿、血液、胸腹水、脓液和各种创面伤口分泌物中分离出的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌共307株,其中大肠埃希氏菌183株,肺炎克雷伯菌124株。
2.抗生素纸片庆大霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻肟、亚胺培南、环丙沙星、头孢西丁、均购于北京天坛中国药品生物制品检定所。
3.培养基水解酪蛋白胨(M-H)琼脂培养基购自北京天坛中国药品生物制品检定所。
4.质控菌株 大肠埃希氏菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(GY2000)。
二、方法
1.药敏试验 采用纸片扩散法,将待检菌稀释成0.5麦氏单位浓度的菌液,均匀涂布于M-H平板,待平板吸收菌液稍干后,贴药敏纸片,每个纸片中心至少相距24mm。药敏结果按美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI))为标准判读[2]。
2.ESBLs筛试验 将临床分离的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌在进行常规药敏试验时,按Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)标准判读结果,如果抑菌圈直径头孢他啶≤22mm、氨曲南≤27mm、头孢噻肟≤27mm、头孢曲松≤25mm、头孢泊肟≤17mm,有其中之一者为可疑产ESBLs菌株。
3.双纸片法确证试验 将待检菌液均匀涂布于M-H平板,将头孢噻肟(30μg)和头孢噻肟(30μg)+克拉维酸(10μg)、头孢他啶(30μg)和头孢他啶(30μg)+克拉维酸(10μg)4张纸片均匀贴于M-H平板上,35℃孵育18小时,测量抑菌圈直径,2对纸片或其中一对的直径相差≥5mm,可确证为产ESBLs菌株[3]。
结果
一、双纸片法确证试验产ESBLs菌株的阳性率(见表1)
二、药敏试验结果见表2
讨论
大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌均为临床最常分离的肠杆菌科细菌,此2种革兰氏阴性杆菌可引起呼吸道、泌尿道、消化道、伤口等感染。本研究显示我院临床分离的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌中产ESBLs阳性率较高(分别为53.6%和47.6%),应引起临床高度重视,把ESBLs的检测纳入常规监测。产ESBLs细菌的发生与医院内侵袭性操作的使用关系密切[4]。这可能与侵袭性医疗操作过程中,损伤了机体的正常防御机能,以及没有严格执行消毒隔离措施、无菌操作规程和屏障护理有关。有研究表明[5-6],产ESBLs细菌可通过手在医院内传播,在医护人员的手、医院的空气、墙壁、塑料制品、病人住的床上表面也分离出该菌。分子流行病学研究结果也提示存在交叉传播或通过某一尚未识别的共同传染源传播的可能。提示在临床医疗中,应尽量减少创伤性操作,以控制产ESBLs细菌感染的发生率,降低死亡率,提高治疗效果。
超广谱β-内酰胺酶是由质粒介导能赋于细菌对头孢菌素类(如头孢他啶、头孢噻肟、头曲松、头孢泊肟)和单酰胺类(氨曲南)以及青霉素类抗生素耐药的一类酶,此酶不仅对某些抗生素的作用和地位带来威胁,还对感染性疾病的治疗和人类健康产生重的影响,由于许多产ESBLs菌株在常规体外药试验中对部分抗生素现为中介、部分敏感、甚至全部敏感,而在感染患者体内却表达为临床意义的耐药,由此常常造成治疗的失败。产 ESBLs菌株的多重耐药性与 ESBLs的基因型、携带多个耐药基因的质粒和细菌本身固有的耐药性有直接关系[7-8] 。
CLSI认为产ESBLs菌对青霉素类,头孢菌素类及单酰胺抗生素均存在有较高程度的耐药。尽管此类药物的体外试验有效,但在治疗中却出现耐药。ESBLs编码质粒往往同时携带氨基糖甙类,磺胺类抗菌药物的耐药基因,因而产ESBLs菌多表现为多重耐药[9]。本研究表明,除亚胺培南外,产ESBL的细菌对不同的β-内酰胺酶类抗生素呈现不同程度耐药。产ESBLs大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌对头孢类抗生素耐药率达73.4%～100%,较不产ESBLs菌株高69.2%～79.5%。对庆霉素、环丙沙星、哌拉西林、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(复方新诺明)的耐药率也达到66.5%、43.9%、70.5%、50.4%。氨苄西林的耐药率达到100.0%。仅亚胺培南敏感率达100.0%。产ESBLs大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素有较高的耐药率,其中对头孢噻肟的耐药率最为突出,达67.4%～85.6%,而对头孢他啶和氨曲南的耐药率相对较低(11.8%～43.7%),这一现象与上海、四川等地报道相似[10-12]。因此临床分离到ESBLs阳性的大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌株时,不管体外药敏试验结果敏感与否,应向临床报告避免使用青霉素类、头孢菌素类和氨曲南。但可用碳青霉烯类、头霉烯类或加酶抑制剂的β-内酰胺类及其他敏感的抗生素。
参考文献
[1]Bush k,Jacoby GA,Medeiors AA.A functional classification scheme forβ-lactamases and its correlation with molecular structure.Antimicrob Agents Chemother,1995,39:1211-1233.
[2]National Committee for Clinical Laboratory Standards ......
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