阴道加德纳菌基因组DNA用不同方法提取的比较
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1.2.3 基因组DNA纯度和浓度测定 使用UV24019C型紫外分光光度仪检测基因组浓度及OD260/OD280值。
1.2.4 普通PCR对基因组DNA定性检测 GV的引物合成参照文献[6],由上海英俊生物公司合成。序列如下:P1,5'-GGGCG GGCTAG AGTGCA3';P2,5'-GAACCCGTGGAATGGGCC-3',产物条带大小为332bp。以GV质控株为模板,以P1和P2为引物,反应体系为25μI Taq mix 12.5μI ,P1μI ,P2 1μI ,模板2μI,dH2O 8.5μI。反应条件:95℃10 min,94℃ 30S,62℃ 30S,72℃ 30S,40个循环,72℃ 7min。使用2%琼脂糖凝胶进行产物检测。
1.2.5 FQ-PCR测定 对6种方法提取的GV基因组DNA作荧光定量PCR,引物同上。PCR反应体积为25μI,PCR参数:94预变性5 min,94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 1min,35个循环,最后72℃ 5min结束反应。根据Ct值对提取效率进行判断。
2 结果
2.1 定性PCR测定结果 对6种方法提取的GV基因组DNA进行普通PCR,PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,均可见332 bp左右的特异性条带。
2.2 荧光定量PCR测定结果 对6种方法提取的GV基因组DNA作荧光定量PCR,从左到右,以改良法CT值最低,其次为酚氯仿抽提法、醋酸钾法、碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法,加热煮沸法CT值最高。具体结果见图1。
图2FQ PCR测定不同方法提取GV基因组DNA
2.3 不同方法提取DNA的比较 通过多次平行试验表明改良法提取效率最高,酚氯仿抽提法和醋酸钾法提取效率次之,碱裂解煮沸法和溶菌酶煮沸法提取效率较差,加热煮沸法提取率最低。具体结果见表1。
表1不同细菌基因组DNA提取方法的比较
3 讨论 在临床微生物检验中,常规分离方法是最基础的,也是最广泛的,但是传统的细菌学检验于鉴定的主要依据是形态特征和生理性状,需要进行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测,方法复杂费时,对有些细菌也往往不能给出理想的鉴定结果[6]。随着分子生物学技术的发展,PCR技术以快速,敏感和特异等优点迅速地应用到临床微生物检测领域。PCR检测细菌的关键之一是模板的选择,即要确定扩增的目的基因。因此,简单实用的细菌基因组DNA的提取是分子生物学技术研究和检测临床细菌的基础。
获得一定浓度和纯度的DNA是进行分子生物学研究的基础。破解细胞壁与细胞膜是获得基因组DNA的前提,而蛋白质和核酸物质的分离是获得高质量DNA产物的关键。目前,细菌基因组DNA提取方法有酚抽提法,专用DNA提取试剂盒法,碱裂解法,加热煮沸法,溶菌酶裂解法,SDS裂解法,及其他破壁方法(超声破碎,研磨破碎,反复冻融等)[7]。DNA经典分离方法是酚/氯仿抽提法,该法虽然效率较高,但费时费力,而且其操作中要求多次离心,增加了样品污染的可能性。在DNA溶液中的酚类等有机物质对DNA聚合酶有抑制作用,特别是在PCR扩增过程中会对扩增过程产生抑制作用。由于采用有机溶剂的处理,试剂有一定的毒性,大量应用有害健康,不适合常规应用。加热煮沸法时间短,操作简单,但加热过程中会有少部分DNA降解导致提取效率较低,同时其最大缺陷是无法提取革兰氏阳性菌基因组DNA;碱裂解法是一种简便的细菌基因组DNA提取方法,但该法提取采用强碱具有一定的腐蚀性;SDS裂解法及溶菌酶法一般需要复杂的裂解液体系并借助蛋白酶K和RNA酶的帮助来获得高质量的抽提产物,部分药品及相关酶试剂价格昂贵[8]。DNA专用试剂盒提取法提取细菌基因组DNA效果好但成本较高,临床应用受到限制。
本文对上述其中几种提取细菌基因组DNA方法进行了对比实验,研究结果证实了各种方法的优缺点。加热煮沸法操作简单,但提取效率低。为缩短操作时间,本研究中将溶菌酶法和碱裂解法与煮沸法结合,碱裂解法提取效率要好于溶菌酶法。本实验结果表明单独使用溶菌酶不能达到良好的提取效果。酚氯仿提取法是经典的提取方法,提取效率较好,但操作繁琐,耗时长。虽然DNA得率高,但荧光定量PCR的CT值却偏低,证实了可能有少量酚残留对PCR扩增的抑制作用。醋酸钾法是用SDS破壁,高盐低PH溶液沉淀蛋白质,用酚氯仿抽提,提取效率稍差。本实验改良法中我们将溶菌酶法和盐析法结合并进行了改良,一次同时加入溶菌酶消化,蛋白酶K降解蛋白,SDS充分裂解细胞并去除有机杂质,然后用饱和氯化钠沉淀蛋白质,并经离心除去,上清直接用乙醇沉淀DNA。该法简化了DNA的抽提步骤,减少了有机溶剂的使用,提取的DNA具有较高的浓度和纯度,适合临床应用,建议各实验室可根据具体要求来合理地选用DNA的提取方法及试剂。
参考文献
[1] 李连青,朱庆义,刘俊芬,等.阴道加德纳菌对细菌性阴道病的病原学诊断评价[J].中华医院感染学杂志,2005,15(2):226.
[2] Witt A,Pet ricevic L,Kaufmann U,et al.DNA hybridization t est:rapiddiagnostic tool for excluding bacterial vaginosis in pregnant women wit hsymptoms suggestive of infect ion[J].J Cl in Microbiol,2002,40(8):3057 ......
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