丹参注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响
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[摘要] 目的 研究丹参注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。方法 制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，采用HE染色法观察脑组织形态学变化、透射电镜观察脑组织超微结构变化、黄嘌呤氧化酶法测定脑组织血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、硫代巴比妥法测定丙二醛(MDA)含量。结果 丹参注射液组再灌注后与相应假手术组相比脑组织MDA含量降低、SOD含量升高(P<0.01)；丹参注射液组再灌注后与模型组相比脑组织中MDA含量降低，SOD含量升高(P<0.05)。结论 丹参注射液通过降低脑组织中NDA的含量，升高脑组织中SOD的含量，从而减轻脑缺血损害。
[关键词] 脑缺血再灌注； 丹参注射液； 超氧化物歧化酶； 丙二醛
[中图分类号] R-33 [文献标识码] B [文章编号] 1005-0515(2011)-12-041-02
近年来，氧化应激学说在缺血性脑血管疾病中的地位日益重要[1]。脑缺血后氧化物生成系统和抗氧化系统之间的平衡被打破，组织内生成大量的自由基可以引起细胞膜脂质过氧化，从而导致细胞膜破坏、细胞溶解、组织水肿和线粒体功能下降等一系列损害作用[2]。本研究采用栓塞大鼠大脑中动脉并再灌注模型，观察丹参注射液对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 动物为健康清洁级SD大鼠,雌雄各50只,体重300g-350g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供；主要仪器为2135型石蜡切片机(德国LEICA公司)，H-600IV型透射电镜(日本日立公司)，Olympus照相显微镜(日本)；试剂为丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物有限公司)，丹参注射液(正大青春宝药业有限公司)。
1.2 实验方法 从50只大鼠随机抽出10只为假手术组，余进行造模；符合纳入标准的大鼠采用随机数字表方法均分为模型组、丹参注射液组，每组10只。参考Zea longa[3]的方法,结扎大鼠颈外动脉，自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线18.5±0.5mm阻断大脑中动脉血流，造成局灶性脑缺血。术后将栓线尾部置于皮下，缺血2h后轻拔栓线造成血流再灌注。假手术组大鼠只进行麻醉和血管分离术。参考Longa[3]的方法进行评分，评分在1-3分的大鼠纳入实验分组。
1.3 治疗方法 ①丹参注射液组：从术前3天开始等量丹参注射液腹腔注射，大鼠体重(kg)*20/3ml，每日1次。②模型组按同样方法予以等量生理盐水腹腔注射。③假手术组同样抓取，不做其它任何处理。
1.4 标本的制备与检测
1.4.1 脑组织病理切片的制取 分别于缺血再灌注后取各组大鼠各4只，用10%水合氯醛(0.3ml/100mg)腹腔注射麻醉，打开颈部，暴露右侧颈总动脉，插管输注4%多聚甲醛约50ml灌注固定，断头取脑,取左侧大脑制作切片标本：在距额极2mm和距尾极1mm处各切一刀，取中间段制成光、电镜标本，观察神经细胞的超微结构变化。
1.4.2 脑组织MDA、SOD检测 各组大鼠余下6只断头处死，在冰盘上迅速取脑，称取左侧大脑组织，放入玻璃匀浆管(玻璃匀浆管下端置于冰水混合物中)进行匀浆。将10%的组织匀浆在低温离心机中以3000r/min，离心10min，取上清液根据试剂盒说明，进行含量检测。SOD采用黄嘌呤氧化酶法，MDA采用硫代巴比妥酸法检测。
1.4.3 HE染色 切片经脱蜡脱水后哈瑞氏苏木精染核，1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，伊红染色，脱水，透明后中性树胶封片。
1.5 统计学方法 全部数据采用SPSS17.0统计软件，各项指标采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，不同组间比较用q检验。
2 结果
2.1 假手术组与模型组、丹参注射液组大鼠脑组织MDA、SOD含量的比较(x±S)
图表说明：1)在假手术组大鼠脑组织MDA、SOD的含量呈基础水平变化。2)模型组再灌注后与相应假手术组相比脑组织MDA含量升高、SOD的含量降低,有极显著差异(P<0.01)。3)丹参注射液组再灌注后与假手术组、模型组相比脑组织MDA含量降低、SOD含量升高,有极显著差异(P<0.01)。
2.2 对缺血性再灌注后脑组织形态学观察
2.2.1 HE染色光镜下观察结果 光镜下检查，模型组缺血侧大脑皮层和纹状体出现严重的神经细胞变性坏死，其中皮层锥体细胞表现为胞体固缩,核浓缩、深染，染色质浓缩、边聚，胞浆呈嗜酸性改变，细胞与周围组织形成显著的间隙，间质疏松，出现空泡性变性。而假手术组神经细胞核仁清晰、核圆形，核膜完整。丹参注射液组可显著改善上述病理变化。图示如下：
图1 丹参注射液组脑组织HE染色(×10)
(描述：脑组织坏死程度最轻，极少部分脑组织稍水肿。)
2.2.2 透射电镜下观察结果 电镜下检查,模型组缺血侧大脑组织超微结构发生严重脱髓鞘病变，线粒体肿胀，粗面内质网扩张，并出现胶质细胞染色质聚集，细胞凋亡。而假手术组未出现脱髓鞘病变，胶质细胞形态、结构较好。丹参注射液组可显著改善上述病理变化。图示如下：
图2 模型组电镜下脑组织超微结构(×8000)
(描述：胶质细胞染色质聚集，细胞凋亡。)
图3 丹参注射液组电镜下脑组织超微结构
(×12000)(描述：较正常的粗面内质网，形态结构较好)
3 讨论 中药丹参临床上应用广泛，有药理及所含成分研究，证明丹参可减少氧自由基的产生，保护血管内皮细胞。改善微循环和细胞出血、缺氧所致的代谢障碍。对体外培养成纤维细胞的研究表明。丹参可明显抑制成纤维细胞的生长和繁殖。同时可增强机体免疫力[4]。
本研究结果表明：丹参注射液具有类似抗氧化作用，可以显著降低缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织中MDA的含量，升高脑组织中SOD的含量，对大鼠脑缺血性脑损伤有较好的疗效。从肉眼到光学显微镜再到透射电镜观察各组大鼠脑组织病理及超微结构变化，提示本药对大鼠的脑组织损伤有可靠的治疗效果。丹参注射液对缺血性脑损伤的保护作用机制可能与其降低脑组织MDA ......
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