ATRA协同BCNU靶向抑制人脑肿瘤干细胞的实验研究
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【摘要】 目的 本实验目的旨在探讨体外全反式维甲酸(ATRA)协同卡氮芥(BCNU)靶向抑制BTSC的细胞和分子生物学机制。通过MTT实验观察ATRA协同BCNU在体外是否抑制BTSC的增殖;利用AO/EB双荧光染色法观察ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中是否有凋亡的发生并利用流式细胞术定量检测凋亡比例。方法 通过MTT实验观察ATRA协同BCNU在体外抑制BTSC的增殖;利用流式细胞术定量测定了凋亡比例.结果 ATRA协同BCNU在体外较单独应用BCNU更能抑制BTSC的增殖,削弱BTSC的自我更新能力;在ATRA协同BCNU体外抑制BTSC过程中有凋亡现象,凋亡比例比单独应用BCNU有显著提高。结论 本实验首次在体外实验中证实ATRA协同BCNU比单独应用BCNU对人脑肿瘤干细胞的靶向抑制效应更大,从而为诱导分化剂和细胞毒性化疗药物在神经外科临床中联合应用治疗较高级别胶质瘤提供了相应的理论和实验基础。
【关键词】胶质瘤,脑肿瘤干细胞,ATRA,BCNU,凋亡
【中图分类号】R739.41 【文献标识码】 B 【文章编号】1005-0515(2010)007-051-03
一、材料与方法
1 材料
1.1 标本取材和实验细胞来源
所有肿瘤标本均来至2006年9月至2010年3月长沙市中医医院神经外科和中南大学湘雅医院神经外科手术中切除的较高级别胶质瘤,共34例。全部标本均经湘雅医院病理科检验证实并按WHO2000年脑肿瘤分类分级标准进行分类。其中Ⅱ级17例、Ⅲ级11例、Ⅳ级胶质母细胞瘤6例。
1.2 全反式维甲酸(ATRA)和卡氮芥(BCNU)溶液的配制
两种药物体外作用人脑肿瘤干细胞的终浓度均参考参考临床用药的最高血浆浓度配制。其中,全反式维甲酸(ATRA)先用无水乙醇溶解,再溶于细胞培养基中,无水乙醇的体积比小于0.1%,终浓度为1×10-6mol/L(0.3μg/ml)。卡氮芥(BCNU)注射液可直接溶于细胞培养基中,终浓度为10×10-6mol/L(2.0μg/ml)。
1.3 MTT液的配制
四甲基偶氮唑盐(MTT)以PBS配制成5mg/ml贮存液,0.22μm滤膜过滤除菌,4℃避光下可保存一周。
1.4 AO/EB荧光染色液的配制
精确称取AO、EB各1mg,分别溶于10ml pH7.2PBS中使之配成100μg/ml的储备液,用前等量混合,备用。
1.5 流式细胞术相关试剂的配制
精确称取1mgRNA酶,溶于1mlPBS中使之配成1mg/ml的储备液,备用。精确称取1mgPI,溶于20mlPBS中使之配成50μg/ml的储备液,备用。
2 方法
2.1 ATRA协同BCNU体外作用人脑肿瘤干细胞的细胞生物学实验
2.1.2 ATRA协同BCNU体外作用人脑肿瘤干细胞的MTT实验
将Ⅱ级5例、Ⅲ级5例、Ⅳ级5例总共15个病例的人脑肿瘤干细胞,用有限稀释法调整细胞浓度,以1000个活细胞/孔的密度接种到96孔板。仍然分为A、B、C三组,A组为空白对照组,培养基中未添加药物;B组为BCNU组,培养基中BCNU终浓度为10×10-6mol/L(2.0μg/ml);C组为BCNU+ATRA组,培养基中BCNU终浓度为10×10-6mol/L(2.0μg/ml),ATRA终浓度为1×10-6mol/L(0.3μg/ml)。每个病例接种12孔,每孔添加120ul无血清培养基,隔日每孔添加20µl新鲜SFM,于接种后5天终止培养,加入5mg/mlMTT液20μl/孔,继续培养4h,可见有不同程度的蓝紫色(Formazo)结晶。以平板离心机进行离心,弃去各孔内液体,每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO),置水平摇床上震荡5min,使细胞内和周围的紫色颗粒充分溶解,再于室温放置10min,于全自动酶标仪上采用575nm波长测定各孔OD575nm值后,进行统计处理,计算出每组各级别病例吸光值的平均值。
2.2 流式细胞术定量检测人脑肿瘤干细胞凋亡比例的实验
将纯化后的人脑肿瘤干细胞调整细胞密度为104/ml, B组为BCNU组,培养基中BCNU终浓度为10×10-6mol/L(2.0μg/ml);C组为BCNU+ATRA组,培养基中BCNU终浓度为10×10-6mol/L(2.0μg/ml),ATRA终浓度为1×10-6mol/L(0.3μg/ml),在培养瓶中培养。5天后将B、C两组的各级别病例的细胞悬液从培养瓶中吸出吹散,将两组相同级别病例的细胞悬液合并,使细胞总数达到1×106,再用流式细胞术定量检测B、C两组各级别细胞凋亡比例(同时检测细胞周期及DNA倍体分析)。
二、结果
1.ATRA协同BCNU体外作用人脑肿瘤干细胞的MTT实验
表1为ATRA协同BCNU体外作用人脑肿瘤干细胞的MTT实验结果,采用多个样本均数间两两比较的SNK检验分析得出结论:在三个级别的病例中,C组的OD575nm吸光值均数较B组均有明显下降,即ATRA协同BCNU较BCNU单独应用更能降低人脑肿瘤干细胞的增殖能力。
2 流式细胞术检测人脑肿瘤干细胞凋亡的定量实验
表2为流式细胞术检测BTSC凋亡的定量实验结果,流式报告中可给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比和细胞倍体并给出凋亡百分比。分析流式报告可以得出结论:在三个级别的病例中,C组的凋亡比率较B组均有明显上升,即在体外作用过程中,ATRA协同BCNU较BCNU单独应用能增加BTSC的凋亡比例。
三、讨 论
以胶质母细胞瘤代表的恶性神经胶质瘤是颅内最恶性的肿瘤,浸润能力、增殖能力强,由于其广泛浸润生长和瘤细胞在远离原发灶存在,决定了其术后应进行系统化疗,尤其在手术和放疗都难以达到疗效的情况下化疗是目前临床上重要的辅助治疗手段,而目前临床公认单独应用的脑胶质瘤化疗药物中BCNU是最有效的[1]。
诱导分化治疗则是肿瘤化学治疗的一个新领域。肿瘤分子生物学的研究表明,恶性肿瘤在发生学上是细胞分化紊乱的结果,其引起细胞分化阻滞的特异性基因改变在一定条件下是可逆的。作为肿瘤治疗的一个新策略,诱导分化治疗的主要目的是将恶性肿瘤细胞转化为成熟且偏良性的细胞,从而逆转肿瘤细胞的恶性表现,协助传统化疗药物直接靶向抑制脑恶性肿瘤中的肿瘤干细胞的增殖和自我更新。在普通的血清分化环境及体内环境中,肿瘤干细胞不能达到最终的分化状态且失去增殖能力,这可能是胶质瘤持续生长及术后复发的原因。而要实现肿瘤干细胞的终末分化,可能需要诱导分化剂的干预。全反式维甲酸(RA)是最早开发的诱导剂,在血液系统肿瘤,淋巴瘤的临床治疗中取得了很好疗效[2,3]。
目前国内外尚无将诱导分化剂和细胞毒性化疗药物联合应用的研究报道。本研究在如下两方面做了一定的创新探索:一是首次将诱导分化剂和细胞毒性化疗药物联合应用,二是将分离培养并纯化的脑肿瘤干细胞做为治疗靶点,研究诱导分化剂是否能协同细胞毒性化疗药物靶向抑制脑肿瘤干细胞,并使用单克隆形成实验、MTT实验、AO/EB双荧光染色法、流式细胞术和半定量RT-PCR实验层层推进,探讨其中相关的细胞与分子生物学机制 ......
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