反义hTERT寡核苷酸对人舌鳞癌细胞凋亡的影响(2)
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参见附件。
2.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Tca8113细胞中CyclinD1和Bcl-2 mRNA 的表达采用RT-PCR法。
用TRIZOL溶液提取细胞总RNA。
温度循环按表中进行。
经2.0%的琼脂糖,将PCR产物10μL,在电压为100V的条件下电泳30min。紫外线下观察并经Kodak Digital系统成像。将目的基因条带与β-actin条带的密度扫描值比值作为目的基因的表达相对水平。
2.6 细胞凋亡检测。调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/mL,700rpm,4℃离心5min,按 AnnexinV-FITC检测试剂盒说明分别加入Binding Buffer、AnnexinV 和5μLPI,避光室温反应15min,在1h内上机检测。
2.7 细胞周期检测。待测样本制成单细胞悬液,用预冷的70%冷乙醇固定,过夜,加入RNase A(终浓度为20μg/mL),37℃孵育30min,重悬于1mL PI染液(终浓度为50μg/mL),4℃避光1h,上机检测,资料用cell Quest细胞周期分析软件处理。
3 统计学处理
所得实验数据以均数±标准差表示,所有数据应用SPSS11.0 for windows统计软件进行处理,组间差异比较采用ANOVA单因素方差分析,以P<0.05认为差异有统计学意义。
4 结果
4.1反义寡核苷酸对Tca8113细胞增殖的影响(OD570nm,±SD)反义寡核苷酸组Tca8113细胞增殖减慢,0.5μM组细胞尚能缓慢增殖,2.0μM组细胞基本无明显增殖,在加反义寡核苷酸72h后,细胞数量低于接种24h时数量。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组Tca8113细胞随培养时间延长呈指数增长,不受影响。见图1。
图1 各组Tca8113细胞增殖曲线
4.2 反义寡核苷酸对Tca8113细胞周期和凋亡的影响。
4.2 细胞形态学变化。在倒置显微镜下观察,反义寡核苷酸组细胞随作用时间和作用浓度的增加,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落;细胞间隙增大,部分细胞核深染,胞膜皱缩,细胞形态呈圆形或椭圆形,作用72h效应较明显。2.0μM反义寡核苷酸组可见细胞凋亡特征性的细胞膜完整但周围出现颗粒的发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间培养72h后连接紧密,分裂活跃,细胞为多边形,触角外展,细胞巢团状分布,无细胞发泡现象,未见凋亡小体。
4.3 DNA ladder琼脂糖凝胶电泳分析。24h时,各组细胞的DNA ladder(“梯状”条带)不明显。反义寡核苷酸组2.0μM在48h时即检测到清晰的细胞凋亡特征性的DNA ladder,72h时,0.5μM、1.0μM和2.0μM反义寡核苷酸均可检测到该梯状条带。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间在三个时间点均未检测到DNA ladder,只在加样孔附近出现明亮的大分子单一条带。
4.4 流式细胞仪法检测细胞凋亡率变化。0.5μM~2.0μM 反义寡核苷酸转染Tca8113细胞培养72h后,与空白对照组比较,Annexin-V /碘化丙锭双染色法检测到细胞早期凋亡率增加,反义寡核苷酸诱导的细胞凋亡率随反义寡核苷酸浓度和培养时间的增加而增高。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组虽随时间增加出现凋亡率略增高,但与空白培养基组无差异。
ANOVA分析,F=75.386,*与空白组比较,P<0.05;正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间比较差别无统计学意义,P>0.05。
4.5 流式细胞仪法检测Tca8113细胞周期。如表3所示,反义寡核苷酸组细胞G0/G1期细胞比率上升,S期细胞比例下降,说明细胞在反义寡核苷酸作用下,细胞周期阻滞在G0/G1期,与正义寡核苷酸组、空载体组和空白培养基组比较有差异(P<0.05)。反义寡核苷酸对Tca8113细胞的细胞阻滞作用随作用浓度和时间的延长,逐渐明显。正义寡核苷酸组、空载体组和空白组比较无显著差异,而且不随作用时间和浓度发生明显变化。
ANOVA分析,F=3.357,*与空白组比较,P<0.05;正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间比较差别无统计学意义,P>0.05。
5 讨论
近年来,端粒酶与恶性肿瘤的高度相关性引起人们的极大兴趣,成为肿瘤领域的研究热点之一。新近较多研究表明抗hTERT能够抑制肝癌、肺癌、白血病和前列腺癌等恶性肿瘤的生长[6~9]。然而,有关抗端粒酶途径治疗口腔鳞癌目前鲜有报道。为进一步探讨抗端粒酶逆转录酶途径治疗舌癌的可行性,并了解其作用的可能机制,我们在本研究中观察了靶向hTERT的反义寡核苷酸对Tca8113细胞增殖和和凋亡的影响,对这一作用相关的分子事件作了一些探索。
反义技术作为基因“封条”,能够特异性封闭或抑制其靶基因的表达。但是,不同的研究针对的靶点不同,有以模板区为靶点,有以启动子区为靶点,其效用也存在分歧。本研究针对hTERT基因设计合成含20个碱基的硫代寡核苷酸,证实反义寡核苷酸在体外对Tca8113 细胞的增殖有明显的抑制作用,此抑制作用呈现一定的浓度和作用时间相关性。本研究中反义寡核苷酸0.5μM时Tca8113增殖出现一定的抑制,但并没有出现细胞大量凋亡的现象,而2.0μM反义寡核苷酸作用48h开始,细胞出现负增长。本研究中也发现一个现象,细胞若继续培养到96h再经过换液培养后,细胞数量并没有出现全面死亡,存留的少量细胞会出现重新分裂、繁殖。这可能是因为:1. 反义寡核苷酸对Tca8113细胞作用有一个有效作用浓度和时间[10]。反义寡核苷酸有瞬间释放的效应,96h后有少量细胞逃脱凋亡的细胞重新分裂繁殖,引发残余肿瘤复发的危机。这现象提示反义hTERT应该重复或多次给药。另外,采取构建质粒的方法,也能持续产生反义序列,但这种方法用于体内可能会造成生物污染,如病毒的转入等[11]。2. 端粒酶抑制剂作为一种快速有效的抗肿瘤方法并不能单独使用。多数研究认为端粒酶hTERT是肿瘤发生发展的必需前提,但不是唯一条件。与顺铂或反义c-Myc基因等联合治疗肿瘤将更彻底杀灭肿瘤细胞。在肿瘤研究领域,可以将反义技术和常规治疗方法相结合,提升治疗肿瘤细胞的综合能力[12] ......
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