核酸体外扩增技术诊断肾结核的临床研究
结核分枝杆菌的细菌学检验是结核病病原学诊断的直接证据，对结核病的诊断具有特殊的价值。但传统的抗酸染色镜检及分离培养结核分枝杆菌检测方法灵敏度差、检出速度慢，远远不能满足临床要求。核酸体外扩增技术，即采用聚合酶链反应(PCR)为结核病建立了一种快速、敏感、特异与简便的细菌学检查方法，被广泛应用于结核病诊断，取得了较好的效果。为探讨PCR在肾结核病原学诊断中的价值，笔者对30例肾结核患者与30例正常对照组的尿液标本应用PCR技术检测结核分枝杆菌，同时镜检及培养比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 病例选择：①肾结核组：30例肾结核均为我院住院及门诊患者，都是根据病史、临床表现、B超、细菌学检查等确诊为肾结核。②非结核组：30例均为正常人体检查者。
1.2 收集标本：取24小时尿液离心沉渣。
1.3 主要试剂及仪器：①菌种来源，采用结核分枝杆菌标准株，由北京胸科医院提供。②结核分枝杆菌PCR诊断试剂盒由华美生物技术公司提供。③PCR扩增仪：美国P-E公司提供的480型。④电泳仪：国产DY-B型。⑤培养基：改良罗氏培养基。
1.4 结核分枝杆菌的检测：①标本中DNA提取：将24小时尿沉渣用2%NaOH处理后加裂解液离心取上清液。②PCR扩增：反应总体积25μl，DNA模板16μl，Ta9DNA聚合酶1μl。94℃1分钟、65℃1分钟、72℃2分钟、循环35次，最后72℃延伸5分钟。③扩增产物检测：取扩增产物10μl加溴酚兰3μl混合后，于2%琼脂糖凝胶上电脉30分钟，然后在紫外灯下观察。如有245bp扩增区带者为阳性，否则为阴性。④每次PCR试验均设空白，阴、阳性对照。
1.5 结核分枝杆菌分离培养按结核病细菌学检查方法的规程。
2 结果
2.1 PCR检测特异性的观察：结核分枝杆菌有245bp扩增区带，而其它细菌均无245bp扩增区带，特异性100%。
2.2 临床标本PCR检测：对30例肾结核与30例非结核标本分别应用PCR、镜检及培养法检测结核分枝杆菌，结果为30例肾结核标本中，PCR阳性23例，镜检阳性1例，培养阳性7例，PCR法明显高于镜检及培养法。30例非结核标本镜检及培养均为阴性，PCR为阴性。
3 讨论
PCR是根据DNA复制原理而没计的核酸外扩增技术。笔者应用这一基因诊断技术对30例肾结核标本与30例非结核标本进行结核分枝杆菌检测，同时与镜检与培养法比较，结果30例肾结核标本三种方法的阳性检出率分别为PCR76.6%，镜检3.3%，培养法23.3%，PCR明显优于其它方法。PCR扩增整个过程是自动化控制，可在数小时内完成，缩短了结核分枝杆菌的检出时间，也充分说明了PCR是一种简便、快速、灵敏度和特异性较高的结核杆菌的检测技术，对肾结核的诊断具有极其重要的价值。
作者单位：331400 江西省峡江县中医院, http://www.100md.com(郭新勇)
1 材料与方法
1.1 病例选择：①肾结核组：30例肾结核均为我院住院及门诊患者，都是根据病史、临床表现、B超、细菌学检查等确诊为肾结核。②非结核组：30例均为正常人体检查者。
1.2 收集标本：取24小时尿液离心沉渣。
1.3 主要试剂及仪器：①菌种来源，采用结核分枝杆菌标准株，由北京胸科医院提供。②结核分枝杆菌PCR诊断试剂盒由华美生物技术公司提供。③PCR扩增仪：美国P-E公司提供的480型。④电泳仪：国产DY-B型。⑤培养基：改良罗氏培养基。
1.4 结核分枝杆菌的检测：①标本中DNA提取：将24小时尿沉渣用2%NaOH处理后加裂解液离心取上清液。②PCR扩增：反应总体积25μl，DNA模板16μl，Ta9DNA聚合酶1μl。94℃1分钟、65℃1分钟、72℃2分钟、循环35次，最后72℃延伸5分钟。③扩增产物检测：取扩增产物10μl加溴酚兰3μl混合后，于2%琼脂糖凝胶上电脉30分钟，然后在紫外灯下观察。如有245bp扩增区带者为阳性，否则为阴性。④每次PCR试验均设空白，阴、阳性对照。
1.5 结核分枝杆菌分离培养按结核病细菌学检查方法的规程。
2 结果
2.1 PCR检测特异性的观察：结核分枝杆菌有245bp扩增区带，而其它细菌均无245bp扩增区带，特异性100%。
2.2 临床标本PCR检测：对30例肾结核与30例非结核标本分别应用PCR、镜检及培养法检测结核分枝杆菌，结果为30例肾结核标本中，PCR阳性23例，镜检阳性1例，培养阳性7例，PCR法明显高于镜检及培养法。30例非结核标本镜检及培养均为阴性，PCR为阴性。
3 讨论
PCR是根据DNA复制原理而没计的核酸外扩增技术。笔者应用这一基因诊断技术对30例肾结核标本与30例非结核标本进行结核分枝杆菌检测，同时与镜检与培养法比较，结果30例肾结核标本三种方法的阳性检出率分别为PCR76.6%，镜检3.3%，培养法23.3%，PCR明显优于其它方法。PCR扩增整个过程是自动化控制，可在数小时内完成，缩短了结核分枝杆菌的检出时间，也充分说明了PCR是一种简便、快速、灵敏度和特异性较高的结核杆菌的检测技术，对肾结核的诊断具有极其重要的价值。
作者单位：331400 江西省峡江县中医院, http://www.100md.com(郭新勇)