芹菜素对糖尿病模型小鼠氧化应激和单核细胞趋化蛋白-1的影响(2)
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参见附件。
2.2 实验动物分组及治疗措施:实验分为正常对照组、糖尿病模型组、AP 治疗组(分为低剂量组(5 mg•kg-1)、中剂量组(10 mg•kg-1)和高剂量组(20 mg•kg-1))，每组各10 只小鼠。每天上午禁食2 h 后腹腔注射给药：AP 治疗组分别按5 mg•kg-1、10 mg•kg-1 和20 mg•kg-1 体质量给药，糖尿病模型组和正常对照组腹腔注射等容量蒸馏水，连续给药30 d。
2.3 血糖测定:于开始给药后30 d 20:00 p.m. 禁食12 h(不禁水)，次日8:00 a.m. 断尾法取血(肝素抗凝)测定空腹血糖。血糖测定采用德国罗氏优越型血糖仪，具体操作严格按照仪器使用说明。
2.4 血清中丙二醛(MDA) 含量和超氧化物歧化酶( SOD)活性检测:与“2.3”同步眼球取血(非肝素抗凝)，室温静止1 h，离心(3000 r•min-1, 5 min)，获取血清，按ELISA 试剂盒说明书的操作步骤进行操作。即待测样品50L 与50L 的生物素标记的抗体于反应孔内混匀，37℃温育1 h，洗涤；加入80L 亲和链酶素-HRP，混匀，37℃温育30 min，洗涤；加入底物A 和B 各50L，混匀，37℃温育10 min；加入50L 终止液，立即用酶标仪在波长450 nm 测定各孔的吸光度A 值。并同步做标准曲线，样品中MDA 和SOD 含量根据其A 值由标准曲线换算出相应的浓度。
2.5 胰腺单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) mRNA 检测:与“2.3”同步获取胰腺，按Trizol 试剂说明提取胰腺总mRNA。使用一步法RT-PCR，逆转录合成cDNA 后进行PCR 扩增MCP-1 基因。逆转录反应条件：65℃ 5min；42℃ 1 h；72℃ 5 min。PCR扩增条件：94℃ 3 min后进行30 个循环扩增(94℃ 30 s；55℃ 40 s; 72℃ 30 s)；72℃ 10 min，以β-actin为内参照。小鼠MCP-1 基因序列的上游引物为5′ACCCTTACACACATCAGCA3′，下游引物为5′CTACCATCAGCACAACAAAGA3′，产物大小为447 bp；β-actin上游引物为5′GTAAAGACCTCTATGCCAACAC3′，下游引物为5′CTAGGAGCCAGAGCAGTAATC3′，产物大小为100 bp。扩增产物用1.2% 琼脂糖凝胶(含1 mg•L-1 EB)电泳，电泳结果采用凝胶成像分析系统成像，并通过quantity one 软件计算MCP-1 与β-actin 条带灰度比值，以表示样本中MCP-1 相对mRNA 水平。
2.6 统计学方法:数据用SPSS 10. 0 软件分析，以均数±标准差(X±s) 表示，n 为例数，多组间比较用one-way ANOVA，两组间比较用非配对Student's t-test，P < 0.05 表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 AP 对糖尿病小鼠血糖的影响:模型对照组小鼠在建模后30 d，空腹血糖值为21.76±1.39 mmol•L-1，明显高于正常对照组(P < 0.01)。经5 mg•kg-1、10 mg•kg-1和20 mg•kg-1 AP 治疗30 d后，与模型对照组相比，血糖显著下降(P < 0.05和P < 0.01)，具有药物剂量依赖性。其中，以20 mg•kg-1 AP 连续给药30 d，血糖下降幅度最大，其血糖值为8.35±0.52 mmol•L-1，属于正常范围(≤11.1 mmol•L-1)。AP对糖尿病小鼠血糖影响见表1。
与正常对照组比较: *P < 0.01；与模型对照组比较: **P < 0.05；与模型对照组比较: #P < 0.01
3.2 AP 对糖尿病小鼠MDA 含量和SOD 活性的影响:将一系列不同浓度的标准品与测定的对应A 值作标准曲线,并进行直线相关回归分析,得出MDA直线回归方程为Y = 0.04 + 0.009X, r = 0. 997；SOD直线回归方程为Y = 0.02 + 0.01X, r = 0. 998(浓度为横坐标(X)，A 值为纵坐标(Y))。将样品测得的A 值代入相应的直线回归方程中,即得到相应的含量。模型对照组小鼠在建模后30 d，与正常对照组相比，血清中MDA 含量明显升高，而SOD 活性明显下降(P < 0. 01)，分别为29.31±1.07 nmol•mL-1和35.78±1.17 IU•mL-1。经5 mg•kg-1、10 mg•kg-1和20mg•kg-1 AP 治疗30 d后，与模型对照组相比，MDA 含量显著下降，而SOD 活性显著上升(P < 0. 05和P < 0. 01)，并具有药物剂量依赖性。AP 对糖尿病小鼠MDA 含量和SOD 活性的影响见表2。
3.3 AP 对糖尿病小鼠胰腺MCP-1mRNA 表达的影响:正常对照组小鼠胰腺MCP-1在mRNA 水平上检测不到其表达，而模型对照组小鼠在建模后30 d，胰腺MCP-1 mRNA 的表达显著上升(P< 0.01)，其DNA 条带灰度比值为2.68±0.24。经5 mg•kg-1、10 mg•kg-1和20 mg•kg-1AP 治疗30 d后，与模型对照组相比，MCP-1DNA 条带灰度比值显著下降，即MCP-1 mRNA 的表达显著下降(P< 0 ......
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