基于PI3K/Akt-mTOR信号通路介导肠源性内毒素血症探讨非酒精性脂肪肝机制的实验研究(1)
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【摘要】
目的：观察非酒精性脂肪肝大鼠PI3K/Akt-mTOR信号通路相关指标、IL-1β、NF-κBp65变化，探讨上述指标在非酒精性脂肪肝发病中的作用。方法：30只SPF级♂SD大鼠，按体重随机分为正常组、模型组，采用改良高脂餐法制备脂肪肝模型。应用光镜、透射电镜等技术观察大鼠肝脏组织形态学变化，应用Real-time PCR技术检测PI3K/Akt-mTOR信号通路相关指标、IL-1β、NF-κBp65 mRNA表达。结果：光镜下见模型组大鼠肝细胞脂变，以中央静脉周围为主，胞浆内充满大量脂肪空泡，形成脂肪细胞，100%存在小叶内炎症，以单核细胞、淋巴细胞浸润为主；电镜下见模型组线粒体增大、肿胀、线粒体内嵴脱落，减少，基质变淡，部分细胞坏死，胞浆内充满脂滴。模型组P85、P-Akt、mTOR、IL-1β、NF-κBp65 mRNA表达均呈高表达变化，与正常组比较，有统计学意义(P<0.05)。结论：炎症状态下PI3K/Akt-mTOR信号通路过度活化介导肠源性内毒素血症在非酒精性脂肪肝的发生、发展中占据重要地位，提示阻断PI3K/Akt-mTOR通路可能为非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。
【关键词】PI3K/Akt-mTOR信号通路；肠源性内毒素血症；非酒精性脂肪肝
【中图分类号】R295 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)10-0407-02
非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指对肝脂类输入或合成和其输出或氧化之间平衡具有调控作用的局部或系统性因素的改变，导致甘油三酯在肝内堆积超过肝脏湿重5%，使肝脏对此后的损害变得易感，最终导致肝细胞炎症和纤维化的一种疾病[1]。1980 Ludwig首次提出NAFLD病名，迄今30余年[2]。流行病学调查发现NAFLD现己成为仅次于慢性病毒性肝炎、酒精性肝病的重要肝硬化前期病变之一[3]，目前该病确切机制尚未阐明，医学界比较公认是“二次打击学说”，即胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)所致甘油三酯堆积看作是对肝脏第一次打击，而在肝脏脂肪沉积基础上所发生的氧应激和脂质过氧化则形成二次打击。近年来，肠源性内毒素血证(Intestinal endotoxemia,IE)在NAFLD发病中的二次打击地位越来越受到重视[4]。笔者基于前期工作基础，从PI3K/Akt-mTOR信号通路介导IE角度探讨NAFLD可能机制，拟为NAFLD防治提供新的思路。
1 一般资料
1.1 实验动物：
SPF级SD♂大鼠30只，体重200±20g，实验动物质量合格证明号：NO0038559，动物由广东省医学动物实验中心提供。所有动物饲养在河源市人民医院消化内科动物室，室温23±2℃，明暗各12h(早六点到晚六点)，适应性喂养1wk后，按体重1：1随机分为正常组，模型组。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 主要试剂：
二甲苯、Harris苏木精液、伊红染色液、1%盐酸酒精、10%中性甲醛、锇酸、电镜固定液、PBS、Tris、无水乙醇、P85、P-Akt、mTOR 、IL-1β、NF-κBp65、GAPDH引物等均由广州达安基因生物技术公司提供，并委托该公司完成Real-time检测工作。
1.2.2 主要仪器：
手术器械、研钵、直灌胃针、金属夹、石蜡油、一次性注射器(1ml、5ml、10ml)；0.5 ml 及1.5 ml Eppendorf管购自美国AEGEN公司、TP1020自动脱水机、RM2135 Leica切片机、HI1210 Leica摊片机、HI1220 Leica烘片机、EG1160Leica自动包埋机、H-600透射电镜、ABI-7500荧光定量PCR仪、柯达凝胶成像系统等。
2 研究方法
2.1 造模方法：
参照文献报道[5]，采用改良高脂餐法(饲料配方：基础饲料83.5%，猪油15%(自制)，胆固醇1.5%，胆酸0.005%)连续喂养8wks制备脂肪肝大鼠模型；正常组大鼠予普通饲料喂养8周，第8周末处死全部大鼠，截取肝脏，分别置于中性甲醛、2.5%戊二醛、液氮中备测。
2.2 指标检测
2.2.1 大鼠肝脏病理组织形态学观察：
将已用10%中性甲醛固定好的大鼠肝脏取出，然后切取病变处，经用流水冲洗，放入生物脱水机进行逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋切片4μM，常规HE染色，封片，光镜下观察肝脏组织形态学变化情况。
2.2.2 大鼠肝脏超微结构观察：
将已用2.5%戊二醛固定后的大鼠肝脏取出，切取病变处<1mm3，用0.1M磷酸漂洗液漂洗，1%锇酸固定液固定后，脱水、包埋、固定，超薄切片机切片 50-60 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察超微结构变化后拍片。
2.2.3 大鼠肝脏PI3K/Akt-mTOR信号通路及肠源性内毒素相关指标检测：
采用Real-time PCR技术检测P85、P-Akt、mTOR、IL-1β、NF-κBp65 mRNA表达变化。(具体步骤： 组织总RNA提取-Primer5.0软件设计引物-逆转录cDNA-Real time PCR 反应体系扩增-目的基因相对mRNA表达水平的计算分析)。
表1P85、P-Akt、mTOR、IL-1β、NF-κBp65、GAPDH引物序列
2.3 统计学分析:
实验数据以均数±标准差(X±s)表示，用SPSS11.5 for Windows软件进行数据处理与分析。计量资料采用t检验进行组间分析，计数资料采用非参数检验，P<0.05为有统计学意义。检验水准为α=0.05。
3 研究结果
3.1 大鼠肝脏组织病理学变化:
正常组：肝细胞排列正常，细胞中央有大而圆的核，肝小叶规则，细胞质均匀无脂滴和炎症细胞浸润；模型组：脂变肝细胞以中央静脉周围为主，极度肿胀呈圆形，体积较正常增加，胞浆内充满大量脂肪空泡，形成脂肪细胞，100%存在小叶内炎症，以单核细胞、淋巴细胞浸润为主。(图1)
图1 注：A：正常组；B：模型组(×20)
3.2 大鼠肝脏超微结构变化:
正常组：线粒体形态正常，结构完整，嵴粒位于内嵴上，嵴清晰，排列规则；模型组：线粒体增大、肿胀、线粒体内嵴脱落，减少，基质变淡，部分细胞坏死，胞浆内充满脂滴。(图2)
3 ......
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