芪蛭益肺药物血清对转化生长因子—β1刺激下肺成纤维细胞中基质金属蛋白酶及其抑制剂基因表达的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
2.3 实时荧光PCR检测
总RNA提取：按照Trizol试剂说明抽提细胞总RNA，所提总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并经紫外分光光度计检测所提RNA含量和纯度。cDNA合成：分别取3 μg总RNA为模板，在加入Oligo(dT)和M-MLV反转录酶后以25 μL体系在42 ℃下反应1 h合成cDNA第一链，之后94 ℃加热3 min以灭活反转录酶。
实时荧光定量PCR扩增：采用SYBR Green I荧光染料技术，在20 μL反应体系中，加入cDNA 2 μL、ddH2O 13 μL、SYBR Green荧光定量PCR Mix 4 μL、引物1 μL。MMP-9上游引物5'-CCTGCCAGTTTCCATTC ATC-3'，下游引物5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3'，产物长度152 bp。TIMP-1上游引物5'-ACACCGCAGCG AGGAGT-3'，下游引物5'-AGGTGACGGGACTGGAAGC-3'，产物长度154 bp。用β-actin基因作为内参，上游引物5'-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物5'- CTCTGTGTGGATTGGTGGCTTAT-3'，产物长度150 bp。
反应条件：94 ℃、10 min，94 ℃、10 s，55 ℃、10 s，72 ℃、10 s，45个循环。同时做溶解曲线以确认是否是单一峰。反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物是否符合原设计片段长度。PCR反应及数据采集在LightCycler 2.0系统上进行，记录其循环阈值(Ct)，每个样品中靶基因的相对基因表达采用相对定量公式2-ΔΔCt计算。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组内不同时间点比较采用独立样本t检验，多组间同时间点比较采用方差分析，方差齐采用LSD进行多重比较，方差不齐采用Tamhane's T2法进行多重比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 芪蛭益肺药物血清对大鼠肺成纤维细胞培养48、72 h后基质金属蛋白酶基因表达的影响
与空白血清组比较，培养48 h后模型组和药物血清组MMP-9 mRNA表达升高(P<0.05)，培养72 h后模型组表达仍高于空白血清组(P<0.05)，而药物血清组表达回到了正常水平。结果见表1。
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件。