糖肾康对高糖诱导人肾小管上皮细胞分泌基质金属蛋白酶—9及其抑制剂—1的影响(2)
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1.4 仪器
CO2培养箱(SANYO MCO-18AIC，日本)，超净生物安全柜(苏净安泰SW-CJ-2FD，中国)，倒置显微镜(Olympus IX51，日本)，酶标仪(Labsystems Multiskan MS 352型，芬兰)。
2 实验方法
2.1 糖肾康药物血清制备
大鼠饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室，普通饲料喂养，随机分为空白组、中药组，每组10只。中药组按成人临床用量的6.5倍给予糖肾康灌胃，空白组灌服等容积生理盐水，每次1 mL/100 g体质量，上下午各1次，连续3 d。末次灌胃前8 h禁食不禁水，30 min后股动脉采血，静置2 h后3000 r/min冷冻离心20 min，取上清液，-20 ℃保存。
2.2 细胞培养与分组
HK-2用含10%胎牛血清的1640培养基培养于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中。每隔1～2 d换新鲜培养基1次，培养融合至80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA消化液消化后，用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前用无血清培养基培养24 h使细胞同步化，实验重复3次。
细胞分为6组。空白组：1640培养液；高糖诱导组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖；对照组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%空白血清；糖肾康低剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+5%糖肾康药物血清；糖肾康中剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+10%糖肾康药物血清；糖肾康高剂量组：1640培养液+30 mmol/L D-葡萄糖+20%糖肾康药物血清。
2.3 基质金属蛋白酶-9及其抑制剂-1检测
细胞接种于24孔板，每孔1 mL，每组2个复孔，培养过夜。按分组加入含相应浓度药物的培养液，每孔1 mL。于24、48 h收集细胞上清液 ......
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