当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞凋亡中热休克蛋白70及内皮型一氧化氮合酶表达的影响(3)
2.5 蛋白印迹法检测热休克蛋白70的蛋白表达收集各组细胞,PBS洗涤,裂解细胞提取总蛋白,考马斯亮蓝法绘制标准曲线,测定蛋白浓度。每组各取50 μL蛋白,经SDS PAGE电泳后转至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,分别加HSP70,β-actin抗体4 ℃孵育过夜,加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h,加ECL发光试剂孵育1 min,暗室将膜在感光胶片上曝光,加显影液,定影液洗像。用Alpha Imager 2200图像分析系统进行灰度扫描,计算HSP70与β-actin灰度比值。
2.6 一氧化氮含量测定
按试剂盒说明书操作,应用硝酸还原酶法及分光光度法测定各组细胞培养上清液中NO含量。
3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示,组间计量资料采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 当归红芪超滤物对过氧化氢致内皮细胞早期凋亡的影响
D1象限代表细胞收集过程中机械损伤细胞碎片;D2象限代表晚期凋亡与坏死细胞;D3象限代表正常细胞;D4象限代表早期凋亡细胞 ......
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