1.5.6 Western blot检测肺组织黏蛋白5AC、水通道蛋白5蛋白的表达

    剪取25 mg大鼠肺组织，加入200 μL RIPA裂解液，于匀浆器中反复研磨后离心提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃金属水浴煮10 min，-20 ℃冰箱保存备用。配制分离胶浓度为8%(分离MUC5AC)和12%(分离AQP5及β-actin)的SDS-聚丙烯酞胺凝胶。在加样孔按顺序加入蛋白样本20 μL及蛋白Marker 4 μL，按浓缩胶恒压80 V、30 min，分离胶120 V、60 min进行电泳。电泳结束后用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，恒流300 mA MUC5AC约2 h，AQP5及β-actin约1 h。转膜完毕后，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉(1×TBST稀释)中室温封闭1.5 h，1×TBST洗涤10 min，加入1×TBST稀释的小鼠MUC5AC单克隆抗体(稀释比1∶200)、AQP5兔多克隆抗体(浓度0.1 μg/mL)和β-actin(稀释比1∶5000)，4 ℃冰箱孵育过夜 ......