iNOS protein (P<0.01) and the phosphorylation levels of JNK protein (P<0.05， P<0.01) in MAPK signaling pathway in macrophages. Fuzheng Huayu Prescription had no significant effect on the mRNA expressions of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in LPS-induced macrophages， and the phosphorylation levels of ERK and p38 proteins in MAPK signaling pathway. Conclusion Fuzheng Huayu Prescription exerts its anti-inflammatory-M1 - polarization effect on RAW264.7 macrophages through inhibiting iNOS gene overexpression and NO overproduction by repressing JNK phosphorylation.
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Keywords： Fuzheng Huayu Prescription; macrophage; NO; iNOS; MAPK signaling pathway; JNK signaling pathway
慢性肝病進展中，肝脏炎症(inflammation)→纤维化(fibrosis)→癌症(cancer)所构成的IFC轴线越来越被人们重视[1]，肝内M1型巨噬细胞炎性极化是肝纤维化发生的始动因素和肝纤维化进展的促进要素。因此，抑制肝脏中肝内M1型巨噬细胞炎性极化，从而减轻肝脏炎症损伤，是肝纤维化乃至肝癌防治中的重要目标。扶正化瘀方由上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所研制，临床广泛用于抗肝纤维化。研究表明，扶正化瘀方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化6个月后，在逆转肝纤维化的同时明显改善肝组织炎症[2]，但其抗炎分子机制尚未阐明。我们前期研究发现，扶正化瘀方能显著抑制M1型巨噬细胞中炎症介质一氧化氮(NO)生成。在M1型巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化L-精氨酸分解产生NO[3]，而MAPK信号通路则是调控iNOS基因表达的重要信号通路[4]。本研究拟探讨扶正化瘀方通过调控MAPK信号通路减少NO生成从而抑制M1型巨噬细胞炎性极化的可能抗炎机制。
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1 实验材料
1.1 药物
扶正化瘀方浸膏粉，上海黄海制药有限责任公司，批号180206。质控标准：褐色粉末，味苦、涩;每克含发酵草菌粉以腺苷不少于1000 g/批，丹参以丹参素钠不少于3000 g/批，丹酚酸B不少于5000 g/批，水分少于8.0%，需氧菌总数不超过1000 cfu/g，霉菌、酵母菌总数不超过100 cfu，大肠埃希菌不得检出。
1.2 细胞株及主要试剂
RAW264.7巨噬细胞株，购自中国科学院干细胞库(编号SCSP-5036)。DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，链霉素、青霉素均(ScienCell公司)，CCK8细胞试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，Corning公司)，脂多糖(LPS，美国Sigma公司)，JNK抑制剂SP600125，(MCE公司)，总RNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)，反转录试剂盒(货号RR047A，TaKaRa公司)，扩增试剂盒(货号RR420A，TaKaRa公司)，BCA蛋白定量试剂盒(货号23227，Pierce化学公司)，iNOS抗体(Abcam公司)，p-JNK、p-ERK和p-p38抗体(美国CST公司)，山羊抗鼠和山羊抗兔的荧光二抗(LI-COR公司)，GAPDH抗体(Proteintech公司)。
1.3 仪器
Odyssey红外荧光扫描成像系统，美国LI-COR公司;垂直板电泳槽、半干电转印系统，美国Bio-Rad公司;ABIViiA7型荧光定量PCR仪，美国ABI公司;多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司。, http://www.100md.com(张满 胡旭东 黄恺 陶艳艳 彭渊 刘成海)