反相HPLC法测定雷公藤内酯醇的含量和有关物质
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摘要 目的：建立反相高效液相色谱法，测定雷公藤内酯醇的含量和有关物质。方法：采用Discovery SUPELCO C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水为流动相，含量等度洗脱测定、有关物质梯度洗脱测定，检测波长219 nm，柱温25 ℃。结果：雷公藤内酯醇含量测定方法中，样品溶液在8～48 ?g/ml浓度范围内线性关系良好(R2= 1.000 0)，平均回收率为99.48%，RSD为0.59%，溶液稳定性好。结论：方法快速、准确，专属性好，灵敏度符合测定要求。
关键词 雷公藤内酯醇 雷公藤内酯酮 梯度洗脱 高效液相色谱
中图分类号：O657.72； R284.1 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2012)21-0049-04
雷公藤内酯醇是第一个被确认具有松香烷结构的二萜类三环氧内酯化合物。自1936年以来从雷公藤中已分离出多种有效成分，主要是生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及多糖，其中二萜类物质雷公藤内酯醇为主要有效药理成分，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种生物活性[1]；此外，雷公藤内酯醇能诱导T细胞的凋亡，抑制多种在自身免疫系统疾病和排异反应中起重要作用的前致炎细胞因子的表达[2]。目前本品标准尚未收录于中国药典，文献资料多报道雷公藤药材或制剂中雷公藤内酯醇提取物的含量测定[3，4]。本文根据样品来源特点及质量控制关键点，针对雷公藤内酯醇试制品及其主要杂质内酯酮的质量监测，采用乙腈-水为流动相体系[5]，研究并建立高效液相色谱方法，可快速、准确测定雷公藤内酯醇的含量和有关杂质。
1 仪器与试药
Agilent 1100液相色谱仪，DAD检测器。色谱柱为Discovery SUPELCO C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)。雷公藤内酯醇试制品：上海皓元化学科技有限公司(批号：20070430、20070604、20070911、20071025)；雷公藤内酯醇标准品：中国药品生物制品检定所(批号：111567-200502，20 mg/支)；乙腈：色谱纯(Fisher试剂)；水：纯化水(密理博纯水仪制备)。
2 试验方法与结果[6]
2.1 含量测定
2.1.1 色谱条件和系统适用性
流动相：乙腈-水(24∶76)；流速：1 ml/min；检测波长：219 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 ?l。理论板数按雷公藤内酯醇峰计算应不低于5 000，雷公藤内酯醇和雷公藤内酯酮峰的分离度应大于1.5。
2.1.2 线性关系
2.1.3 精密度试验(重复性)
2.1.4 稳定性测定
2.1.5 回收率试验
2.1.6 定量限
2.2 有关物质检测方法
2.2.1 色谱条件和系统适用性
2.2.2 专属性考察
2.2.3 灵敏度试验
取2.1.2项下浓度8 ?g/ml的溶液，再等比稀释成一系列浓度的溶液，取10 ?l注入液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比。当浓度为0.04 ?g/ml时，其S/N≈3，最小检测限为0.4 ng，灵敏度符合测定要求。
2.3 三批样品测定结果
3 讨论
雷公藤内酯醇不溶于水，溶于二甲亚砜、甲醇、乙腈等有机溶剂，并在这些溶剂中稳定，在配制溶液时应先用适量乙腈溶解，再用流动相稀释。在预试验时考察甲醇-水、乙腈-水不同流动相体系，结果表明以乙腈-水为流动相系统梯度洗脱时，待测组分雷公藤内酯醇、内酯酮与其它组分能有效分离，结果准确可靠，峰形更好。另外，将雷公藤内酯醇和内酯酮的混合对照品在200～400 nm范围内进行扫描，最大吸收波长为219 nm，故最终选择乙腈-水作为流动相梯度洗脱，219 nm作为检测波长。
本研究用的雷公藤内酯醇试制品是从天然植物雷公藤根皮或叶子中提取得到的，工艺过程是以醇水浸提植物、浓缩、水洗、氯仿提取、过柱、丙酮重结晶等流程得到的。本研究目的是建立一种适应样品来源的HPLC分析方法，作为一种定量分析方法，重复性好(RSD<0.2%)、线性关系良好(R2=1.000)及准确性高。有关物质的分析方法为梯度洗脱，具有较高的专属性，尤其是对其中的雷公藤内酯酮的控制，为雷公藤内酯醇试制品的质量控制提供了快速、准确的方法。
此外，该试制品是我公司一类新药雷腾舒的起始原料，其品质将直接影响成品的质量情况和稳定性，因此建立稳定、可靠的质量控制指标，从源头把好质量关，非常重要。本研究针对雷公藤内酯醇含量、有关物质这两个关键质量项，建立了方法，并通过详细的验证确保方法的准确、可靠和可重复，为成品的质量提供了良好的保障。
参考文献
[1] 段冶， 魏晨， 张学强. HPLC法检测雷公藤超声提取物中雷公藤内酯醇的含量[J]. 中医药信息， 2009， 26 (1)： 79-80.
[2] Brinker AM ......
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