注射用克林霉素磷酸酯无菌检查方法验证
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【摘要】目的:确定注射用克林霉素磷酸酯的无菌检查方法。方法:采用薄膜过滤法，通过确定冲洗量、选择阳性对照菌及加入顺序。结果:经试验各实验菌能够正常生长。结论:方法学验证采用薄膜过滤法进行的无菌检查方法可行、有效。
【关键词】注射用克林霉素磷酸酯；薄膜过滤法；验证试验；冲洗量
【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)05-0263-01
克林霉素磷酸酯为化学半合成的克林霉素衍生物，它的脂溶性及渗透性比克林霉素好，该药对革兰氏阴性球菌和厌氧菌有很强的抗菌活性，且对厌氧菌感染有良好的疗效。根据2005年版药典的规定，当建立药品无菌检查时，应进行方法验证，以证明其方法的适用性。因此，针对注射用克林霉素磷酸酯[1]的抑菌特性采用适宜方法消除其抑菌活性，拟建立克林霉素磷酸酯的无菌检查方法[2]。
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1 材料与方法
1.1 仪器:HTY-2000A型集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器(批号：20060623)，杭州泰林生物技术设备有限公司。
1.2 检品:注射用克林霉素磷酸酯；规格：600mg/瓶；批号：070117；苏州天马医药集团天吉生物制药有限公司。
1.3 培养基和稀释液硫乙醇酸盐流体培养基(060524)、改良马丁培养基(060523)、营养肉汤培养基(060216)、改良马丁琼脂培养基(060523)、营养琼脂培养基(060811)、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨(0606005)缓冲液,上海中科昆虫生物技术开发有限公司。
1.4 菌种:金黄色葡萄球菌-第2代、枯草芽孢杆菌-第3代、铜绿假单胞菌-第3代、生孢梭菌-第3代、白色念珠菌-第3代、黑曲霉-第2代。江苏省药品检验所。
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1.5 菌液制备: ①取经(32.5±2.5)℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的营养肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
②取经(32.5±2.5)℃培养18～24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7，备用。
③取经(25.5±2.5)℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养基液体培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6，备用。
④取经(25.5±2.5)℃培养5～7d的黑曲霉斜面培养物，加5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，洗下黑曲霉孢子，取孢子悬液1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4，备用。
1.6 试验用菌液检验：①金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌取上述10-5～10-7备用稀释液各1ml，置45℃营养琼脂培养基皿，(32.5±2.5)℃培养48h，活菌计数。
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②生孢梭菌：取上述生孢梭菌10-6备用稀释液1ml置12ml硫乙醇酸盐液体培养基中，(32.5±2.5)℃培养48h，菌团应清晰可数。
③白色念珠菌和黑曲霉：取上述白色念珠菌10-6稀释液及上述黑曲霉10-4孢子悬液各1ml，置45℃改良马丁琼脂培养基皿,(25.5±2.5)℃培养，活菌计数。
1.7 薄膜过滤法验证试验[3]，选择冲洗液用量，进行过滤与冲洗：取六套一次性的全封闭三联桶滤器。每株菌株准备供试品20支。6株菌准备检品总量至少120支。
①先用0.1%蛋白胨水溶液少量润湿滤膜，直至液体顺利流出。②取检品40支,按每支半量转移至500ml的0.9%无菌氯化钠溶液中,分别均匀滤入两个滤器中，完毕后，用0.1%蛋白胨水溶液冲洗，每次每桶冲洗液100ml，滤干后再循环操作，冲洗总量每桶分别为300ml, 500ml，抽干。③另一滤桶内不过滤检品，其它操作相同，加入同体积的培养基和等量的同种菌种，作阳性对照。④其余5组按上述方法依次操作。
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2 结果
2.1 试验用菌液的活菌计数，其含菌量应为50～100cfu•ml-1, 计数结果详见表1。
2.2 验证试验的培养与观察：分别将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁液体培养基各100ml滤入相应冲洗抽干滤桶器中，将计数的6株试验菌分别加入相应滤桶。硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，改良马丁液体培养基置23～28℃,培养3～5天，逐日观察、记录不同冲洗量对6株阳性代表菌的影响。检品冲洗量实验结果，即检品验证结果，详见表2。
3 讨论
从表2的实验结果得出，注射用克林霉素磷酸酯，按规定取量，用0.1%蛋白胨水溶液以500ml/桶的量冲洗时，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌及黑曲霉无明显抑菌活性，均可使其正常生长。由此得出注射用克林霉素磷酸酯采用薄膜过滤法进行无菌检查时，取样量,60支，用0.1%蛋白胨水溶液的冲洗量应为细菌500ml/桶，每次冲洗量为100ml，能达到冲洗效果。本品按薄膜过滤法进行无菌检查可行，有效。
参考文献
[1] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准，WS1-(X-020)-2003Z
[2] 中华人民共和国药典,二部[S],北京化学工业出版社,2005: 附录89-93
[3] 中国药品检验标准操作规范[S],北京：中国医药科技出版社,2005:313, 百拇医药(海福莲 王亚清 孙永明)