益肾I方对PCOS大鼠胰岛素抵抗及氧化应激抑制作用
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2009年7月1日
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[摘要]目的:观察益肾I方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠胰岛素抵抗以及氧化应激-自由基损伤的作用。方法:采用十一酸睾酮加绒促性素(HCG)建立PCOS大鼠模型,连续口服给予二甲双胍或不同剂量的益肾I方4周,观察大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、睾酮(T)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、空腹血糖(FBG)和口服葡萄糖后2h血糖(OGTT-2hBG)和胰岛素含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)-一氧化氮合酶(NOS)活性,并计算胰岛素敏感指数(ISI)的变化。结果:PCOS大鼠TNF-α,T,MDA,NO,FBG,OGTT-2hBG和胰岛素水平以及iNOS-NOS活性,均明显升高,而SOD活性和ISI,则显著降低,与空白对照组比较,差异有高度显著性(P<0.01);二甲双胍和益肾I方高和中2个剂量均能不同程度地改善PCOS大鼠的上述病理改变(P<0.01~0.05)。结论:益肾I方能改善PCOS大鼠胰岛素抵抗和高雄激素血症,以及对抗氧化应激-自由基损伤,并提高抗氧化能力。
[关键词]益肾I方;多囊卵巢综合征;胰岛素抵抗;氧化应激-自由基损伤
[中图分类号]R588.6
[文献标识码]A
[文章编号]1006-1959(2009)07-0010-03
多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是妇科最常见的内分泌疾病之一,可引起月经紊乱(主要为月经稀发、闭经)、不孕、多毛、痤疮等,远期还可能增加心血管疾病、糖尿病的患病风险[1]。氧化应激、炎症和内皮细胞活跃伴随着PCOS,尤其是其动脉粥样硬化的病理过程发展[2]。资料表明[1],氧化与抗氧化机制失衡(活性氧代谢失衡),从而产生氧化应激损伤,使卵泡发育受损,卵泡不能成熟(不能排卵),患者可能出现月经紊乱(闭经、月经稀发)、不孕,后两者正是PCOS的特征之一。由此推测,氧化应激(活性氧代谢失衡)可能是PCOS的发病机制之一。益肾Ⅰ方是广州市中医医院的院内制剂,由益母草、丹参、黄芪和六味地黄汤组成,在阿霉素诱导肾病综合征大鼠实验中证明具有抗氧化作用[3]。本研究探讨益肾Ⅰ方对PCOS模型大鼠的氧化应激作用,结果报道如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物等级和来源:SPF级SD雌性出生9dD乳鼠,广东省医学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(粤)2003002。SPF级动物实验室,室温23~25℃,相对湿度40%~70%,每小时换新风15次。广东省实验动物设施许可证号为SYXK(粤)2003002。普通饲料均由广东省医学实验动物中心提供。
1.1.2药物及试剂:十一酸睾酮注射液及植物油,浙江仙琚制药股份有限公司提供,批号:020501;注射用绒促性素(HCG)粉针剂,丽珠集团丽珠制药厂生产,批号:030603B;益肾I方(由黄芪、丹参、益母草加六味地黄汤组成)9种单味中药颗粒剂,均由广东一方制药厂生产,用前按比例混合配成混悬剂;二甲双胍片:深圳市中联制药有限公司产品,批号:200305095;SOD和iNOS-NOS活性、MDA、NO含量,试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;肿瘤坏死因子(TNF-α,批号:2004091911)和睾酮(T,批号:2004121915),购自大连华仪理工有限公司代理的DRLab.CaliforniaUSA(美国)公司ELISA试剂盒;胰岛素(Ins,批号:13487)ELISA试剂盒购自大连华仪理工有限公司代理的德国DRG公司。
1.1.3主要仪器:美国宝特BIO-TEKELX800酶标仪;DL-5A离心机(上海安亭科学仪器厂);XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂);UV-2800紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);ECHO爱康全自动血液生化分析仪;ONETOUCHII(Lifescan,美国强生)血糖仪及配套的试纸;Thermofora-80℃冰箱。
1.2方法
1.2.1动物造模及分组[4-6]:除空白对照组外,各组皮下注射十一酸睾酮5mg/kg体重(用中性油注射用油稀释)。空白对照组出生9dDSD雌性乳鼠16只注射同量的中性注射用油;注射完成70dD后,取阴道涂片连续观察11dD,以阴道涂片连续出现角化细胞判定为造模成功;取造模成功大鼠70只,每14只一组按体重随机分为5组:模型阴性组,二甲双胍组250mg/kg•d,益肾I方高剂量组25g/kg•d,益肾I方中剂量组12.5g/kg•d,益肾I方低剂量组6.25g/kg•d;每日灌胃给予药物,空白对照组和模型阴性组则灌胃给予双蒸水,连续6周;给药后第15dD,除空白对照组外,其余造模大鼠肌注入绒毛膜促性腺激素(HCG)1.5u/只,每天二次,连续9dD;在SD大鼠108~122日龄时,每天取阴道涂片,以出现规则性周期为排卵标准;第123d,禁食过夜,参照文献[7]方法,测定大鼠空腹血糖(FBG)和口服葡萄糖后2h血糖(OGTT-2hBG),并计算胰岛素敏感指数(ISI);第125d,空腹称重后,眼眶放血,取血清留冰箱待检。各项测定指标的具体操作步骤参见各试剂盒说明书。
1.2.2统计学处理:P<0.05作为数据统计差异的显著性;实验数据用(x±s)表示。采用SPSS13.0统计软件进行数据统计,计量资料采用组间t检验处理。
2结果
2.1益肾I方对PCOS大鼠血糖、胰岛素含量及胰岛素敏感指数的影响:结果表明,PCOS大鼠FBG,OGTT-2hBG和胰岛素含量明显高于对照组,ISI降低,与空白对照组比较,差异有高度显著性(P<0.01);二甲双胍和益肾I方高和中剂量能不同程度地改善PCOS大鼠血糖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗的病理改变(P<0.01),结果见表1。
2.2益肾I方对PCOS大鼠血清T,SOD,iNOS和总NOS活性及及MDA,NO和TNF-α含量的影响:结果表明,PCOS大鼠TNF-α,T,MDA,NO,FBG,OGTT-2hBG和胰岛素水平以及iNOS活性,均明显升高,而SOD活性和ISI则显著降低,与空白对照组比较,差异有高度显著性(P<0.01);二甲双胍和益肾I方各剂量能不同程度地改善PCOS大鼠上述指标的病理改变(P<0.01~0.05),结果见表2。
3讨论
目前,制备PCOS动物模型最常用的是雄激素模型[8]。十一酸睾酮是睾酮的长效制剂,其肌肉注射t12可达70dD[9]。按实验设计要求,PCOS动物模型的造模时间恰达药物作用的t12。因此,选用十一酸睾酮代替脱氢表雄酮或丙酸睾酮作为造模药物。雄激素制作病理模型存在不足:不产生PCOS表现的卵巢白膜增厚及体积增大,相反其体积和重量只有正常的1/2,在激素改变方面,模型鼠血中LH不增加反而减少,对FSH和卵巢楔形切除术不敏感,此与人PCOS有很大差别。Poretsky等[5]实验证实,大鼠单独应用绒毛膜促性腺激素(HCG)卵巢体积轻度的增加,并出现小囊,与PCOS有相同的卵巢形态变化,而未使用HCG大鼠不发生多囊样改变,阴道涂片检查病鼠无排卵 ......
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