STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepG1*2稳定转染株的建立及鉴定(2)
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2010年5月1日
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1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-); 3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7:M:DL2000
图2 pcDNA3.1(-)/STARD7重组细胞G418鉴定图
Fig 2.Identification of G418 in reconstituted cell pcDNA3.1(-)/STARD7
M:DL 2000;1:HepG1*2;2:HepG1*2/pcDNA3.1(-);3:HepG1*2/pcDNA3.1(-)/STARD7
图3 各转染组细胞STARD7基因的mRNA水平变化
Fig 3 Expression of STARD7 mRNA in different transfected cells
1,2:转染空载体的HepG1*2细胞;3,4:转染STARD7的HepG1*2细胞
图4 Western-blot检测重组细胞STARD7表达
Fig.4 The expression of STARD7 transfected with HepG1*2
3.讨论
STARD7是一编码295个氨基酸残基,分子量为34.7kDa的新型蛋白质,其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析,发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)。为进一步研究STARD7过表达后对肿瘤细胞的生物学功能的影响,在本实验中我们将此基因构建在真核细胞表达载体pcDNA3.1(-),经限制性核酸内切酶酶切鉴定、测序证实目的基因STARD7序列正确,成功构建重组子pcDNA/STARD7。然后将所构建的含STARD7基因的重组质粒转染到HepG1*2细胞,并用G418筛选稳定转染细胞株,选择抗性克隆,将新的克隆细胞挑选出扩大培养。为了鉴定STARD7基因是否已经转染到HepG1*2细胞中,我们通过扩增G418抗性基因PGKneo序列来鉴定,因为pcDNA3.1(-)中带有G418抗性基因PGKneo,该序列是很特异的,人的HepG1*2细胞中不含有该序列,如果没有转染的细胞,那么就扩增不出492bp的特异条带。而且转染了STARD7基因的HepG1*2细胞,其STARD7目的条带比转染了空质粒的HepG1*2及未转染的HepG1*2细胞在mRNA水平及蛋白水平表达量均增加,表明STARD7基因已经转染到HepG1*2细胞中并且有此蛋白的过量表达。本实验为进一步研究STARD7基因对肿瘤细胞的生物学功能的影响奠定了实验基础。
参考文献
[1] John Colicelli.Human RAS Superfamily Proteins and Related GTPases[J].Sci.STKE,2004,(250),re13.
[2] Larry A.Feig.Ral-GTPases:approaching their 15 minutes of fame[J].TRENDS in Cell Biology Vol.13 No.8 419-425(7) August 2003.
[3] Gary Oxford,Charles R,Owens,Brian J,Titus,Tonia L,Foreman,et.al.RalA and STARD7:Antagonistic Relatives in Cancer Cell Migration[J].Cancer Res,2005,65:(16).August 15,2005.
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