小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定(2)
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2010年9月1日
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3.2前脂肪细胞的原代培养。关于小鼠前脂肪细胞的取材及原代培养的方法,虽然在很多文献及参考书中都有记载,但通过本课题组无数次的摸索终于确立了比较稳定的培养方法。通过消化法获取细胞后接种在培养瓶或培养板中,放入置37℃,体积分数5%CO2培养箱内培养。24h后,用PBS轻轻洗去培养板或培养瓶内未粘附的物质,并更换培养液。通过多次摸索发现,如细胞持续应用含高血清的培养液,细胞增殖迅速,但分化会受到抑制,不利于对细胞的分化进行研究。所以,如要维持前脂肪细胞的增殖则用含高血清(20%小牛血清)的F12培养液,如实验的目的是研究前脂肪细胞的分化则可更换为含低血清(10%小牛血清)或无血清的F12培养液。
3.3前脂肪细胞的鉴定。由于原代培养的细胞成分比较复杂,所以在正式实验前必须对所培养的细胞进行鉴定,以使实验的结果真实可信。由于前脂肪细胞存在增殖和分化两个不同的过程,所以为了对前脂肪细胞进行鉴定,也要分为两个过程进行指标检测。
3.3.1原代培养小鼠前脂肪细胞的增殖过程:在增殖过程中,所用培养液为含20%小牛血清的F12培养液。
在倒置显微镜下动态观察细胞,细胞的形状由小圆形渐成梭形,细胞数量增殖明显,聚集性生长成放射状。胞浆内基本无脂肪颗粒,直至2周左右时部分细胞内出现少量脂滴。从形态可知,该细胞来源于脂肪组织,细胞呈梭形,胞浆内无或有很少脂滴。
细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。所以,在增殖过程中要绘制小鼠前脂肪细胞的生长曲线。目前大多数实验室采用的方法是利用培养板采用MTT比色法来进行生长曲线绘制。MTT比色法的检测原理为细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。通过生长曲线的绘制,观察到小鼠前脂肪细胞在3天开始增殖,4-10天加速,第11左右进入增殖平台期。从生长曲线可知,小鼠前脂肪细胞的倍增时间为60h左右。说明该细胞增殖迅速,并且与来自同一个体的成纤维细胞在倍增时间上接近。
3.3.2原代培养小鼠前脂肪细胞的分化过程:在分化过程中,在细胞接种24h后,换用含10%小牛血清的F12培养液。
在倒置显微镜下动态观察细胞,细胞形状由小圆形变为梭形再变为椭圆形或圆形,在胞浆内也逐渐出现反光颗粒,并且颗粒逐渐变为反光小滴。由于经油红O染色细胞内的脂质可特异性着红色,反光小滴在油红O染色后呈红色,提示为细胞内有富含脂肪的液滴,证实为脂肪细胞。由于该细胞的胞浆逐渐出现脂肪颗粒及脂滴,说明其具有分化为脂肪细胞的潜能。油红O是一种特异的可以和细胞内甘油三酯结合的红色染料,与未分化细胞和细胞外脂质不结合。有文献报道其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似。因此我们用油红O染色提取法这一简便、快速的方法对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定,同时作为对体外培养的前脂肪细胞分化程度的间接定量分析的指标。结果表明,小鼠前脂肪细胞在培养2天后开始有脂肪的积聚,4天后积聚量明显增多,于培养8d后迅速增加,16d左右到达高峰,与形态学上的培养4天后细胞内出现脂肪颗粒相吻合。
众所周知,甘油磷酸脱氢酶(GPDH)是甘油三酯合成所必需的限速酶,其最终促使前脂肪细胞发生细胞形态的改变,胞浆充满脂滴,变成脂肪细胞。甘油磷酸脱氢酶(GPDH)是前脂肪细胞分化中晚期的标志[11]。GPDH含量的测定有2种方法:第1种方法,参考Hauner方法[12],细胞培养到一定时间,用PBS(pH7.4)冲洗,25mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)含EDTA1mmol/L收集细胞,超声波细胞粉碎仪40W、10s粉碎细胞,标本-70℃保存。GPDH测定采用速率法测定NADH消耗速率,使用生化分析仪,反应溶液包括100mmol/L三乙醇胺-HCl缓冲液(pH7.5),2.5mmol/LEDTA,0.1mmol/L巯基乙醇,0.4mmol/LNADH,4mmol/L磷酸二羟丙酮。GPDH测定结果以每克蛋白质的IU表示(IU/g)。蛋白质测定采用考马斯亮蓝方法;第2种方法,本课题也采用这种方法,即酶组织化学提取法,根据Stuart等的方法进行测定,画出时间-OD值曲线。结果表明,甘油磷酸脱氢酶在4天左右开始上升并迅速增加,10天左右到达高峰并维持在较高水平。同时发现,甘油磷酸脱氢酶的迅速增加先于脂肪含量的迅速增加,说明酶的出现在前,脂肪的出现在后。
本课题目研究中采用了酶消化法获得了成分均一,增殖和分化均旺盛的梭形细胞,经以上4种鉴定方法,证明是具有典型特征的前脂肪细胞,符合文献中提出的3个标准[13],即:①来自脂肪组织,形态为梭形,胞浆内无或很少有脂肪颗粒。②增殖迅速,与来自同一个体的成纤维细胞在倍增时间上接近。③在形成单层汇合后能变为脂肪细胞,包括脂肪细胞特异性酶的出现和胞浆内出现脂肪颗粒,并且胰岛素是这个过程中的主要促进因素。这4种鉴定方法的选择,均源于前脂肪细胞所具有的生物学特性,如甘油磷酸脱氢酶(GPDH)在前脂肪细胞分化的中晚期出现,是分化的标志酶之一;通过形态学方法观察到脂滴的出现,相应地细胞内脂肪含量也会增加。
参考文献
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[8]Stuart J,Simpson JS.Dehydrogenase enzyme cytochemistry of unfixed Leucocytes ......
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