小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定(1)
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【摘要】本文结合文献报道及本课题组实验研究,对小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定进行了总结。同时,由于前脂肪细胞的分化与肥胖病的形成有密切的关系,故前脂肪细胞的培养具有很重要的研究意义。
【关键词】前脂肪细胞;原代培养;鉴定
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.124文章编号:1006-1959(2010)-09-2409-02
脂肪组织在体内有在胞浆内积聚脂滴的成熟脂肪细胞和虽未在胞浆内积聚脂滴但有这种潜能的前脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形,前脂肪细胞呈梭形,成熟的脂肪细胞失去分裂及增殖的能力,而前脂肪细胞则有分裂和增殖的能力。由于前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化了的前体细胞,与肥胖有着非常密切的关系,笔者参照多本参考书及有关文献报道,在科研中对前脂肪细胞的培养及鉴定方法进行了验证和比较,结合本课题组反复的实践对其进行了总结,拟为进一步研究奠定基础。
由于小鼠的取材比较方便,而且关于小鼠前脂肪细胞的培养研究得比较多,故本课题组所采用的前脂肪细胞均取自小鼠。
1.材料与方法
1.1实验材料:实验选用体重为18-22g的4周龄昆明种雄性小鼠。由成都中医药大学实验动物中心提供。动物在实验前适应性驯养1周,动物房温度和湿度分别维持在20℃和70%左右。实验药品主要有F12培养基、胰酶(Trypsin)、小牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、油红O等。实验主要使用仪器设备包括二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置相差显微镜等。
1.2实验方法:
1.2.1小鼠前脂肪细胞的取材及原代培养:小鼠前脂肪细胞的培养方法,参照杨建梅等所发表文献[1-3]及《体外培养的原理与技术》[4]、《组织培养技术及其在医学研究中的应用》[5]等书所载方法进行培养。
1.2.1.1断脊髓处死雄性小鼠,在培养室无菌条件下解剖小鼠,剪取小鼠附睾附近的脂肪组织,放入培养皿中的D-Hanks液中,反复洗涤之后,用剪刀充分剪碎,将组织移入离心管。
1.2.1.2用吸管加入适量0.25%胰酶在37℃条件下消化(消化时间根据具体情况而定),离心后,收集沉底的细胞,在离心管内加入适量含20%小牛血清的F12培养液,用吸管混匀后吸取细胞及培养液经筛网过滤入另一离心管,上清及漂浮的脂肪组织弃去不用。
1.2.1.3再次离心后,弃上清,沉积的细胞用培养液制成细胞悬液,接种至培养板或培养瓶中,并根据实验需要高调整细胞的密度。在倒置显微镜下观察细胞呈小圆形,置37℃,体积分数5%CO2培养箱内培养。
1.2.1.424h后,用PBS轻轻洗去培养板或培养瓶内未粘附的物质,并更换培养液,如要维持前脂肪细胞的增殖则用含高血清(20%小牛血清)的F12培养液,如实验的目的是研究前脂肪细胞的分化则可更换为含低血清(10%小牛血清)或无血清的F12培养液,以后每2-3天换一次培养液。
1.2.2小鼠前脂肪细胞的鉴定方法:
1.2.2.1细胞形态学观察:在倒置显微镜下,动态观察胞浆内出现脂肪颗粒的程度和快慢并照相。也可进行油红O染色并照相。
1.2.2.2MTT比色法及生长曲线的绘制:细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。现在,大多数实验室利用培养板采用MTT比色法测OD值来进行生长曲线的绘制[6]。
1.2.2.3油红O染色提取法测定细胞内脂肪含量的动态变化:根据Ramirez等[7]方法动态测定,以OD值表示,画出时间-OD值曲线。
1.2.2.4酶组织化学提取法测定前脂肪细胞分化过程中的标志物-甘油磷酸脱氢酶(GPDH)含量的动态变化:GPDH是前脂肪细胞分化中晚期的标志,根据Stuart等[8]的方法进行测定,以OD值表示,画出时间-OD值曲线。1.3统计方法:实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS12.0软件进行统计学分析。单因素方差分析、组间差异分析采用t检验。
2.实验结果与分析
2.1原代培养小鼠前脂肪细胞的增殖过程:
2.1.1小鼠前脂肪细胞的形态学观察:接种消化分离的细胞12小时基本可以贴壁,贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大(见图1)。培养过程中始终应用含高血清(20%小牛血清)F12培养液。2天即可观察到细胞渐成梭形,在3天左右此梭形细胞开始增殖,4-10天加速,聚集性生长成放射状(见图2),细胞融合后生长减慢。增殖过程中的前脂肪细胞使用油红O完全不能着色。2周左右时部分细胞内出现少量脂滴,而这种自然成脂分化的细胞所占比例较少。
图1小鼠原代前脂肪细胞 图2小鼠原代前脂肪细胞
接种12h(未染色,×400)接种4d(未染色,×200)
2.1.2小鼠前脂肪细胞的生长曲线,(见图3):
图3小鼠前脂肪细胞在含高血清F12培养液中的生长曲线
由(图3可知),小鼠前脂肪细胞在3天开始增殖,4-10天加速,第11天左右进入增殖平台期。从生长曲线可知,小鼠前脂肪细胞的倍增时间为60h左右。
2.2原代培养小鼠前脂肪细胞的分化过程:
2.2.1小鼠前脂肪细胞的形态学观察:接种消化分离的细胞12小时基本可以贴壁,细胞贴壁后初为小圆形,核/浆比例较大。接种24小时后换用含低血清(10%小牛血清)F12培养液。2天即可观察到细胞渐成梭形,并且细胞体积增大。4天左右细胞胞浆内可观察到反光脂肪颗粒,大小不等且多散在(见图4)。随分化进展,积聚有脂肪颗粒的细胞增多。到1周或2周时,细胞由梭形逐渐变成椭圆形或圆形,分化成多脂滴或单脂滴的脂肪细胞(见图5),12-14天小脂肪滴融合成大脂肪滴并将细胞核推向细胞一侧(见图6)。胞浆中反光小滴聚积成葡萄串状,经油红O染色细胞内脂质特异性着红色,未分化细胞和细胞内非脂质聚积部分不能着色,提示为细胞内有富含脂肪的液滴,证实为脂肪细胞(见图7)。
图4小鼠原代前脂肪细胞图5小鼠原代前脂肪细胞
接种4d(未染色,×200)接种8d(未染色,×200)
图6 小鼠原代前脂肪细胞图7小鼠原代前脂肪细胞
接种14d(未染色,×400)接种8d(油红O染色,×400)
2.2.2小鼠前脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量的动态变化(见图8):
图8细胞分化过程中细胞内脂肪含量的变化
由(图8可知),小鼠前脂肪细胞内的脂肪含量于培养8d后迅速增加,16d左右到达高峰。 ......
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