PCR-RLFP方法检测IL-6基因启动子区-634C/G多态性实验条件研究(2)
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注：M为D2000的DNA分子量标记，依次为100 250 500 750 10002000bp；1～6：28、56、84、112、140和168μmol/L的dNTP浓度。
2.2 BsrBI内切酶实验条件酶切反应体积:虽然一般试剂盒的标准酶切体系为50μl，但结合众多文献报道和实验，50μl的反应体积所需的扩增产物量以及内切酶的量均过大，不适宜进行大量的酶切，而且RFLP只需要酶切后电泳检测得出酶切图谱，无后续实验需要，因此设定反应体积为20μl，在此基础上确定酶量和扩增产物量。
确定酶切所用的扩增产物量:选择一个能被完全切开而扩增产物量多的模板，用扩增产物2～8μl进行酶切，酶足够量(10U)、酶切时间延长至过夜，如图5所示。结果表明：2、4、6、8μl时均可被切开，6、8μl的PCR产物酶切后有极少量的未被切干净的痕迹，但不影响判断基因型。2μl电泳结果分辨不清晰，而4μl时结果清晰可辨。为保证能够酶切完全并且防止过多的扩增产物对内切酶的抑制，选择4μl为最佳酶切产物量。
图4扩增产物量对酶切的影响
注：M为100bp递增的DNA分子量标记；1～4：2、4、6、8μl的扩增产物。
确定酶切的酶量:加入已经确定的扩增产物量，将内切酶的量设计为2.5U～10U四个梯度，酶切时间足够(过夜)，如图6所示。结果表明：2.5U、5U、7 U、和10U时没有明显差异，均呈现清晰的120bp一条片段(因为60bp片段看不到)，说明2.5U的酶量足以完全切开4μl的扩增产物，2.5U内切酶为最合适的酶量。
图5内切酶量对酶切的影响
注：M为100bp递增的DNA分子量标记；1—4：2.5U、5U、7.5U、10U的BsrBI内切酶量。
确定酶切时间:酶切反应体系相同，即各加入确定的扩增产物量、内切酶量，酶切时间设置为1～24h，如图7所示。结果表明：1、3、5、7、9h酶切在原180bp处均有少量痕迹，而9h以后痕迹不明显，不影响分辨，而且随酶切时间延长并未发现非特异性切割，所以选择过夜切割(超过9小时)为最佳酶切时间。
图6酶切时间的确定
注：M为100bp递增的DNA分子量标记：1～6分别为酶切1、3、5、7、9和24h
3讨论
PCR-RFLP方法是检测DNA片段是否存在已知位点变异的常用方法 ......
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