α-烯醇化酶重组质粒的构建及其表达形式的研究(2)
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参见附件。
2.1.2 按Trizol試剂操作说明提取HUVEC总RNA，采用大连宝生物工程有限公司的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行cDNA合成，包含基因组DNA除去反应和逆转录反应两个步骤。
①基因组DNA除去反应见表1。
点动混匀后，于42℃水浴2min，得反应液，放置于4℃冰箱保存。
②逆转录反应逆转录反应液在冰盒上配置。为保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制Master Mix(见表2)，然后再分装到每个反应管中。
点动混匀后，经37℃反应15min，85℃反应5sec后，得cDNA合成产物，置于4℃冰箱保存。
2.2 ENO1目的基因的扩增和纯化
2.2.1 PCR引物设计及合成根据GenBank中的ENO1基因序列设计引物，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
上游引物P15'CGCCATATGATGTCTATTCTCAAG 3'
下游引物P25'TCTCGAGTGCCCACAGCTTACTTG3'
其中，"CATATG"和"CTCGAG"分别为Nde I和Xho I的酶切位点。
2.2.2 ENO1目的基因的扩增 以上述逆转录所得cDNA合成产物为模板，利用设计的引物进行PCR扩增目的基因ENO1，反应条件见表3。
反应完成后取5μl样品上样于1.0%的琼脂糖凝胶并进行电泳鉴定，其余放入-20℃冰箱保存备用。
2.3 目的片段ENO1和载体pET28a的连接经切胶纯化得到的DNA溶液与载体pET28a经限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切后，利用T4连接酶进行连接，反应产物为重组质粒ENO1-pET28a。连接反应体系见表4。
将连接反应产物上样于1.0%的琼脂糖凝胶并进行电泳鉴定。
2.4 重组质粒ENO1-pET28a的表达与鉴定氯化钙法制备BL21(DE3) E.Coli.大肠杆菌感受态细胞，将重组质粒ENO1-pET28a进行转化。采用天根生化(北京)科技有限公司生产的质粒小提中量试剂盒提取转化后的质粒。按表5重组质粒ENO1-pET28a的酶切鉴定反应体系对提取的重组质粒进行鉴定，将酶切反应产物上样于1.0%的琼脂糖凝胶并进行电泳鉴定。将阳性重组子菌液送大连宝生物工程有限公司测序 ......
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