加味银杏饮联合骨髓干细胞移植对大鼠心肌损伤的影响
摘要：目的 制作大鼠心肌损伤模型，采用加味银杏饮联合骨髓间干细胞(BoneMesenchymalstemcells，BMSCs)移植干预，观察心肌细胞凋亡、心功能，从而探讨加味银杏饮的作用机制。方法 采用松开左冠状动脉前降支结扎的方法建立大鼠心肌损伤的模型，将大鼠分为移植组、加味银杏饮联合移植组等两组，观察心肌毛细血管密度(MCD)、心肌纤维化。结果 联合移植组与单纯移植组大鼠心功能均有所改善，而加味银杏饮联合移植组改善更明显。其AI较单纯移植组明显减少，而缺血区MVD 明显增加。结论 在心肌损伤大鼠模型中，加味银杏饮联合细胞移植可以减少梗死区面积，增加梗死区心室厚度，促进梗死区血管再生，改善心功能；同时，加味银杏饮干预能促进大鼠心肌细胞增殖，比单纯细胞移植效果明显；加味银杏饮联合细胞移植能增加移植BMSCs的存活率，在改善大鼠心功能，促进血管再生，促进心肌细胞增殖方面优于细胞移植组和中药组。
关键词：骨髓干细胞；心肌损伤；加味银杏饮；移植好
心肌损伤是心肌的坏死，病情凶险。目前治疗手段主要以药物和冠状动脉介入手术为主，这些手段在一定程度上可以缓解患者的症状，但均难从根本上解决问题，本实验采用加味银杏饮联合骨髓干细胞移植治疗实验性大鼠心肌损伤，以观察其疗效并探讨其可能的作用机制。具体实验方法和结果报道如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物2 月龄SD大 鼠 3 只(制备MSCs用)，雄性，体质量 (100±20)g；健康成年SD大 鼠16只，雄性，体质量 (250±20)g，中国人民解放军第四军医大学动物中心提供。
1.1.2药物银杏饮组(银杏30g、檀香5g、砂仁5g)和加味银杏饮组(银杏20g，檀香6g，砂仁5g，赤芍10g，川芎6g，当归6g，红花6g，生地12g，黄芪20g)，由湖南株洲中医院药剂科提供 。
1.1.3 主要仪器与试剂 小动物呼吸机、二氧化碳孵箱(HERA cel 1)，激光共聚焦显微镜，percol1 分离液(pharmacia 公司)，F12～DMEM 培养基、进口胎 牛血清 (JIBCO 公司)，BrdU (pharmacia 公司)，小 鼠抗 BrdU单克隆抗体，小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体，FITC标记的山羊抗小鼠二抗，HP5500 超声诊断仪，TUNNEL 试剂盒 (武汉博士德生物技术公司)。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1分组 成年SD大鼠20只分为加味银杏饮联合移植组 与单 纯移植组，造模前分别灌服等体积加味银杏饮浸膏干粉溶剂以及生理盐水进行灌服14d。
1.2.2干细胞的分离、培养以及纯化 研究中将3只幼龄大鼠杀死，将其浸泡在75%的乙醇中，浸泡时间控制在5min，然后采用PBS对大鼠体进行有效的冲洗，然后去下大鼠的股骨、胫骨等组织并将其放在平皿中，更换相关器械，将大鼠周围肌肉组织除去，并采用PBS冲洗。将大鼠骨干的两个关节面去除，使得骨髓腔充分暴露，并采用7号针头将两骨端进行穿刺，利用5 mL10%FBS的 F12～DbIEM 冲出骨髓入离心管，1500 r/min 离心10 min。弃上清，用 F12～DMEM重悬细胞，轻轻叠加到新鲜配制的密度为1.073的percol 1分离液上，然后进行30min离心，离心速度控制在2500 r/min，取上层浑浊液，并采用PBS进行2次洗涤，最后使用F12～DMEM 培养液 (培养液中主要有10%胎牛血清、100U/mE青霉素等)重悬细胞，按1×10 /mE密度进行接种，37 ℃、5%饱和湿度的c0。孵箱培养，培养5d后更换培养液，并将未贴的细胞壁去除。接近融合的MSCs用含 0.1 mmo l/LEDTA 的 0.25%胰酶室温消化，按 1：3 比例传代，传至第3代。MSCs回植前48h ，换用含 5 ～unol/L 5～BrdU的F12～DbIEM 培养液培养 。临用前加入 0.25%胰蛋 白酶消化 ，然后进行离心，并搜集目标细胞，并根据情况调整细胞密度。
, 百拇医药
1.2.3造模 在15d左右采用O1ivette方法对两组法术进行分析，并建立冠状动脉建立急性心肌损伤模型。建模过程中采用50mg/kg 戊巴比妥对大鼠进行腹腔麻醉，并建立静脉通道，让大鼠心脏完全暴露，采用以4～0 无损伤线进行灌装动脉前支结扎。两组大鼠进行1h后结扎，并且在直视下采用微量注射器在大鼠心肌梗死周围进行标记，并植入标记 5～BrdU 的 MSCs(5 ×10个细胞/100 pL)，每点 25，关胸。
1.2.4 缺血区微血管密度检测 冰冻切片 PBS 冲洗两遍，加入1：50 抗 CD31 小鼠单抗，放在温度为4℃下过夜，PBS 洗涤后加 1 ：50 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育 50 m in，洗 片后用伊文氏兰复染，50%缓冲甘油封片。于荧光显微镜下观察 CD31 阳性细胞，CO31 阳性细胞胞浆呈绿色，采用高倍镜视野对大鼠毛细血管进行观察，并采用CD31 阳性数表示，每张取5个视野。
1.2.5 统计学方法 搜集的数据采用SPSS16软件分析，计数资料行卡房检验，采用n(%)表示，计量资料行t检验，采用(均数±方差)表示，P<0.05表示具有统计学意义。
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2 结果
2.1骨髓间充质干细胞变化 接种后的细胞24h可见较多圆形细胞悬浮在培养液中，48 h可见贴壁细胞，较悬浮细胞体积大，大小较均一，核大多为圆形，位于细胞中央。8～9d 后，部分细胞成梭形，个别成三角形。换液后 5～7d 基本融合铺满，至第 3 代，细胞呈长梭形集落样分布，形态较均一。
2.2组大鼠移植后4w心肌缺血区微血管密度检测 400 倍视野下，联合移植组微血管密度即CD31 阳性细胞(243±20.3)。较单纯移植组 (197±12.6) 明显增加(P<0.05)。
3 讨论
近年来研究发现，通过冠脉或心肌局部注射将 MSCs 导入心肌缺血的微环境中。可以分化为血管内皮细胞 (Ec)。促进局部血管新 生。达到 改善 心肌 缺血 目的，从而成 为心血 管领域 的研究热点。新生血管的形成可降低梗死灶周边肥大心肌细胞的凋 亡，挽救有活力的心 肌细胞，减少胶 原沉着 ，改善心功 能 。但由于 MSCs 在体内缺血微环境中的分化效率有限，因此，是否存在一种方法可以提高 MSC s 的分化效率，增加血管新生，提高疗效呢？ 本实验旨在观察和探讨应用加味银杏饮联合 MSCs 移植可否促进 MSC s 向血管内皮细胞分化，从而提高局部 MvD，改善心功能，降低心肌细胞凋亡。研究结果发现：加味银杏饮联合移植组心功能改善更为明显，且联合移植组心肌细胞凋亡指数较单纯移植组明显降低，MvD 明显增加。表明加味银杏饮具有协助 MSCs 移植 治疗心肌 损伤 、提高局部微血管密度、改善心功能、减少心肌细胞凋亡的作用，可望为临床协助 MSCs 移植增加疗效提供一种安全、有效的治疗手段 。
, 百拇医药
参考文献：
[1] Fukuda K.Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchyma l stem celis for cardiovascu lar tissue engineer ing[J].ArtifOrgans，2001，25：l87-193 .
[2J Itescu S，Kocher AA.Schuster MD.Myocard ial neovascular ization by adult bone marr ow - derived an g ioblas s：strategies forimprovement of cardiomyocyte function [J].Heart Fai1 Rev，2003，8 (3)：253- 258.
编辑/冯焱, 百拇医药(邹瑾 李雅 尹进)
关键词：骨髓干细胞；心肌损伤；加味银杏饮；移植好
心肌损伤是心肌的坏死，病情凶险。目前治疗手段主要以药物和冠状动脉介入手术为主，这些手段在一定程度上可以缓解患者的症状，但均难从根本上解决问题，本实验采用加味银杏饮联合骨髓干细胞移植治疗实验性大鼠心肌损伤，以观察其疗效并探讨其可能的作用机制。具体实验方法和结果报道如下。
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1 资料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物2 月龄SD大 鼠 3 只(制备MSCs用)，雄性，体质量 (100±20)g；健康成年SD大 鼠16只，雄性，体质量 (250±20)g，中国人民解放军第四军医大学动物中心提供。
1.1.2药物银杏饮组(银杏30g、檀香5g、砂仁5g)和加味银杏饮组(银杏20g，檀香6g，砂仁5g，赤芍10g，川芎6g，当归6g，红花6g，生地12g，黄芪20g)，由湖南株洲中医院药剂科提供 。
1.1.3 主要仪器与试剂 小动物呼吸机、二氧化碳孵箱(HERA cel 1)，激光共聚焦显微镜，percol1 分离液(pharmacia 公司)，F12～DMEM 培养基、进口胎 牛血清 (JIBCO 公司)，BrdU (pharmacia 公司)，小 鼠抗 BrdU单克隆抗体，小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体，FITC标记的山羊抗小鼠二抗，HP5500 超声诊断仪，TUNNEL 试剂盒 (武汉博士德生物技术公司)。
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1.2 实验方法
1.2.1分组 成年SD大鼠20只分为加味银杏饮联合移植组 与单 纯移植组，造模前分别灌服等体积加味银杏饮浸膏干粉溶剂以及生理盐水进行灌服14d。
1.2.2干细胞的分离、培养以及纯化 研究中将3只幼龄大鼠杀死，将其浸泡在75%的乙醇中，浸泡时间控制在5min，然后采用PBS对大鼠体进行有效的冲洗，然后去下大鼠的股骨、胫骨等组织并将其放在平皿中，更换相关器械，将大鼠周围肌肉组织除去，并采用PBS冲洗。将大鼠骨干的两个关节面去除，使得骨髓腔充分暴露，并采用7号针头将两骨端进行穿刺，利用5 mL10%FBS的 F12～DbIEM 冲出骨髓入离心管，1500 r/min 离心10 min。弃上清，用 F12～DMEM重悬细胞，轻轻叠加到新鲜配制的密度为1.073的percol 1分离液上，然后进行30min离心，离心速度控制在2500 r/min，取上层浑浊液，并采用PBS进行2次洗涤，最后使用F12～DMEM 培养液 (培养液中主要有10%胎牛血清、100U/mE青霉素等)重悬细胞，按1×10 /mE密度进行接种，37 ℃、5%饱和湿度的c0。孵箱培养，培养5d后更换培养液，并将未贴的细胞壁去除。接近融合的MSCs用含 0.1 mmo l/LEDTA 的 0.25%胰酶室温消化，按 1：3 比例传代，传至第3代。MSCs回植前48h ，换用含 5 ～unol/L 5～BrdU的F12～DbIEM 培养液培养 。临用前加入 0.25%胰蛋 白酶消化 ，然后进行离心，并搜集目标细胞，并根据情况调整细胞密度。
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1.2.3造模 在15d左右采用O1ivette方法对两组法术进行分析，并建立冠状动脉建立急性心肌损伤模型。建模过程中采用50mg/kg 戊巴比妥对大鼠进行腹腔麻醉，并建立静脉通道，让大鼠心脏完全暴露，采用以4～0 无损伤线进行灌装动脉前支结扎。两组大鼠进行1h后结扎，并且在直视下采用微量注射器在大鼠心肌梗死周围进行标记，并植入标记 5～BrdU 的 MSCs(5 ×10个细胞/100 pL)，每点 25，关胸。
1.2.4 缺血区微血管密度检测 冰冻切片 PBS 冲洗两遍，加入1：50 抗 CD31 小鼠单抗，放在温度为4℃下过夜，PBS 洗涤后加 1 ：50 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育 50 m in，洗 片后用伊文氏兰复染，50%缓冲甘油封片。于荧光显微镜下观察 CD31 阳性细胞，CO31 阳性细胞胞浆呈绿色，采用高倍镜视野对大鼠毛细血管进行观察，并采用CD31 阳性数表示，每张取5个视野。
1.2.5 统计学方法 搜集的数据采用SPSS16软件分析，计数资料行卡房检验，采用n(%)表示，计量资料行t检验，采用(均数±方差)表示，P<0.05表示具有统计学意义。
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2 结果
2.1骨髓间充质干细胞变化 接种后的细胞24h可见较多圆形细胞悬浮在培养液中，48 h可见贴壁细胞，较悬浮细胞体积大，大小较均一，核大多为圆形，位于细胞中央。8～9d 后，部分细胞成梭形，个别成三角形。换液后 5～7d 基本融合铺满，至第 3 代，细胞呈长梭形集落样分布，形态较均一。
2.2组大鼠移植后4w心肌缺血区微血管密度检测 400 倍视野下，联合移植组微血管密度即CD31 阳性细胞(243±20.3)。较单纯移植组 (197±12.6) 明显增加(P<0.05)。
3 讨论
近年来研究发现，通过冠脉或心肌局部注射将 MSCs 导入心肌缺血的微环境中。可以分化为血管内皮细胞 (Ec)。促进局部血管新 生。达到 改善 心肌 缺血 目的，从而成 为心血 管领域 的研究热点。新生血管的形成可降低梗死灶周边肥大心肌细胞的凋 亡，挽救有活力的心 肌细胞，减少胶 原沉着 ，改善心功 能 。但由于 MSCs 在体内缺血微环境中的分化效率有限，因此，是否存在一种方法可以提高 MSC s 的分化效率，增加血管新生，提高疗效呢？ 本实验旨在观察和探讨应用加味银杏饮联合 MSCs 移植可否促进 MSC s 向血管内皮细胞分化，从而提高局部 MvD，改善心功能，降低心肌细胞凋亡。研究结果发现：加味银杏饮联合移植组心功能改善更为明显，且联合移植组心肌细胞凋亡指数较单纯移植组明显降低，MvD 明显增加。表明加味银杏饮具有协助 MSCs 移植 治疗心肌 损伤 、提高局部微血管密度、改善心功能、减少心肌细胞凋亡的作用，可望为临床协助 MSCs 移植增加疗效提供一种安全、有效的治疗手段 。
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参考文献：
[1] Fukuda K.Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchyma l stem celis for cardiovascu lar tissue engineer ing[J].ArtifOrgans，2001，25：l87-193 .
[2J Itescu S，Kocher AA.Schuster MD.Myocard ial neovascular ization by adult bone marr ow - derived an g ioblas s：strategies forimprovement of cardiomyocyte function [J].Heart Fai1 Rev，2003，8 (3)：253- 258.
编辑/冯焱, 百拇医药(邹瑾 李雅 尹进)
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