人类microRNA—1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定(2)
MiRNA是一类由20-23个碱基组成的非编码单链RNA，MiRNA与靶基因mRNA的非翻译区域的碱基互补配对，MiRNA与靶基因mRNA结合形成沉默复合体使mRNA降解，从而阻碍mRNA的翻译[1]。肿瘤细胞的多种生物学行为受到MiRNA的调控，MiRNA的功能与细胞的分化、增殖、凋亡、耐药、侵袭及转移等密切相关[2]。我们的前期实验表明microRNA-1246的表达量在宫颈癌患者的癌组织中较正常人宫颈组织升高，microRNA-1246的表达量在宫颈癌患者的癌组织中较癌旁组织升高，microRNA-1246是一个促癌因子，miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力具有一定的影响[3]。慢病毒(Lentivirus)载体是将人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)改良后发展起来的用于基因治疗的载体，是逆转录病毒的一种。它对非分裂细胞和分裂细胞均具有较强的感染能力，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，因为对该病毒进行了改良，使之失去了传染性能，因此安全性高。作为干预宫颈鳞状细胞癌生长及体内试验的措施之一，我们构建了miR-1246慢病毒过表达载体及抑制载体，为进一步观察miR-1246在宫颈鳞状细胞增殖中的作用及其机制奠定了基础。
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1 资料与方法
1 一般资料
1.1.1细胞来源以及培养 人胚胎肾细胞(293T)、人宫颈鳞状细胞癌细胞(siha)均购于上海中国科学院。293T细胞用含10%的FBS的DMEM培养，siha用含10%的FBS的1640培养。
1.1.2质粒及菌株 携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体GV280以及Helper1.0 、Helper2.0购自上海吉凯基因科技有限公司。GV280具有绿色增强荧光蛋白(EGFP)标志和ampricillin抗药基因。感受态大肠杆菌DH5α菌株购于北京天根生物科技公司。
1.1.3主要试剂 限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶 T4DNA连接酶购自NEB公司，DL10，000 DNA Marker购于上海TaKaRa公司，2×Taq PCR Master Mix购于上海吉凯基因科技有限公司，质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技公司，PCR引物合成及质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司进行。
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1.2方法
1.2.1引物设计及合成 根据mirBase数据库得到hsa-miR-1246 MIMAT0005898 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG据DNA重组要求及其他文献[4]报道，设计抑制载体上游引物5' AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，下游抑制载体引物5'- CCGG - CCTGCTCCAAAAATCCATT -3'。在上游引物的5'端及3'端分别加入限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位点及相应的保护碱基，在上游引物的3'端加入6个T作为终止子。
1.2.2重组慢病毒质粒的构建 microRNA-1246抑制GV280载体，GV280转化感受态大肠菌DH5α进行质粒扩增，质粒大提后获得足够量的GV280载体。GV280质粒用限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切，按照酶切说明书操作，置于37°反应3 h或过夜，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，并测定其浓度。对引物进行PCR扩增得到相应的DNA产物，并对PCR产物进行电泳鉴定。PCR产物与双酶切线性化载体以2：1的比例在T4DNAligase作用下进行连接，按照说明书操作，16°连接3 h或过夜。连接产物直接转化感受态细胞，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基的平板上孵育，37°5%的CO2培养过夜。
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1.2.3重组慢病毒质粒的鉴定 挑取固体LB培养板上长出的单颗菌落接种于含有氨苄霉素的5ml LB液体培养基进行培养，分好组，并置于37°、200 r/min的恒温摇床振荡，10～16 h后行对液体培养基中的大肠杆菌行PCR鉴定，引物为载体测序引物，对 GV280-mir1246-down插入基因microRNA-1246进行自动测序，与microRNAbase中反义核苷酸序列比较。将阳性克隆的培养菌液取100 μl送测序检查，测序采用下游测序引物进行反向测序。测序结果与原始序列进行比对。将正确插入载体质粒的转化菌放入500 ml含氨苄霉素的LB培养液中，37°振荡过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒按照厂家提供的说明书提取质粒DNA，测定浓度(1 ug/ul)和纯度，用作以后的转染。
1.2.4 GV280-mir-1246down质粒表达GFP的检测 用lipo200分别将重组质粒转染293T细胞，于转染24 h后在荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白GFP的表达。
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1.2.5 GV280-mir-1246down重组慢病毒的包装与质量检测 包装质粒Helper1.0、Helper2.0分别感受态大肠杆菌DH5α进行扩增，接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单颗克隆菌落于5 ml的LB培养基扩增，用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒并检测质粒浓度。用lipo2000将GV280-mir-1246down+ Helper1.0、Helper2.0共转染包装细胞293T.48～72 h，收集培养液上清，1500 r/min离心5 min去除细胞碎片。再用孔径为0.45 um的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，获得的培养基液上清则分别为含有microRNA-1246、GFP基因的重组病毒。同时将GV280、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞(空载载体对照，重组病毒仅携带GFP基因)。
1.2.6慢病毒低度检测 采用逐孔稀释法，测定前1 d，将293T细胞接种于96孔板，每孔加入4×104个细胞，体积100 μl。分为8个组，第一组加入的病毒原液为1E+1μl；以此类推到第八个组分别为1E+0μl、1E-lμl、1E-2μl、1E-3μl、1E-4μl、1E-5μl、1E-6μl。感染病毒液24 h后在显微镜下观察细胞荧光数，则该病毒的滴度就等于发荧光的细胞数除以病毒的原液量。, http://www.100md.com(赖月华 姚德生 杜萍 卢艳)
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1 一般资料
1.1.1细胞来源以及培养 人胚胎肾细胞(293T)、人宫颈鳞状细胞癌细胞(siha)均购于上海中国科学院。293T细胞用含10%的FBS的DMEM培养，siha用含10%的FBS的1640培养。
1.1.2质粒及菌株 携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体GV280以及Helper1.0 、Helper2.0购自上海吉凯基因科技有限公司。GV280具有绿色增强荧光蛋白(EGFP)标志和ampricillin抗药基因。感受态大肠杆菌DH5α菌株购于北京天根生物科技公司。
1.1.3主要试剂 限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶 T4DNA连接酶购自NEB公司，DL10，000 DNA Marker购于上海TaKaRa公司，2×Taq PCR Master Mix购于上海吉凯基因科技有限公司，质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技公司，PCR引物合成及质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司进行。
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1.2方法
1.2.1引物设计及合成 根据mirBase数据库得到hsa-miR-1246 MIMAT0005898 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG据DNA重组要求及其他文献[4]报道，设计抑制载体上游引物5' AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，下游抑制载体引物5'- CCGG - CCTGCTCCAAAAATCCATT -3'。在上游引物的5'端及3'端分别加入限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位点及相应的保护碱基，在上游引物的3'端加入6个T作为终止子。
1.2.2重组慢病毒质粒的构建 microRNA-1246抑制GV280载体，GV280转化感受态大肠菌DH5α进行质粒扩增，质粒大提后获得足够量的GV280载体。GV280质粒用限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切，按照酶切说明书操作，置于37°反应3 h或过夜，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，并测定其浓度。对引物进行PCR扩增得到相应的DNA产物，并对PCR产物进行电泳鉴定。PCR产物与双酶切线性化载体以2：1的比例在T4DNAligase作用下进行连接，按照说明书操作，16°连接3 h或过夜。连接产物直接转化感受态细胞，涂布于含氨苄霉素的LB固体培养基的平板上孵育，37°5%的CO2培养过夜。
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1.2.3重组慢病毒质粒的鉴定 挑取固体LB培养板上长出的单颗菌落接种于含有氨苄霉素的5ml LB液体培养基进行培养，分好组，并置于37°、200 r/min的恒温摇床振荡，10～16 h后行对液体培养基中的大肠杆菌行PCR鉴定，引物为载体测序引物，对 GV280-mir1246-down插入基因microRNA-1246进行自动测序，与microRNAbase中反义核苷酸序列比较。将阳性克隆的培养菌液取100 μl送测序检查，测序采用下游测序引物进行反向测序。测序结果与原始序列进行比对。将正确插入载体质粒的转化菌放入500 ml含氨苄霉素的LB培养液中，37°振荡过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒按照厂家提供的说明书提取质粒DNA，测定浓度(1 ug/ul)和纯度，用作以后的转染。
1.2.4 GV280-mir-1246down质粒表达GFP的检测 用lipo200分别将重组质粒转染293T细胞，于转染24 h后在荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白GFP的表达。
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1.2.5 GV280-mir-1246down重组慢病毒的包装与质量检测 包装质粒Helper1.0、Helper2.0分别感受态大肠杆菌DH5α进行扩增，接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单颗克隆菌落于5 ml的LB培养基扩增，用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒并检测质粒浓度。用lipo2000将GV280-mir-1246down+ Helper1.0、Helper2.0共转染包装细胞293T.48～72 h，收集培养液上清，1500 r/min离心5 min去除细胞碎片。再用孔径为0.45 um的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，获得的培养基液上清则分别为含有microRNA-1246、GFP基因的重组病毒。同时将GV280、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞(空载载体对照，重组病毒仅携带GFP基因)。
1.2.6慢病毒低度检测 采用逐孔稀释法，测定前1 d，将293T细胞接种于96孔板，每孔加入4×104个细胞，体积100 μl。分为8个组，第一组加入的病毒原液为1E+1μl；以此类推到第八个组分别为1E+0μl、1E-lμl、1E-2μl、1E-3μl、1E-4μl、1E-5μl、1E-6μl。感染病毒液24 h后在显微镜下观察细胞荧光数，则该病毒的滴度就等于发荧光的细胞数除以病毒的原液量。, http://www.100md.com(赖月华 姚德生 杜萍 卢艳)