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编号:13073907
三氧化二砷对人成纤维样滑膜细胞生长的影响
http://www.100md.com 2016年8月20日 《医学信息》 2016年第33期
     摘要:目的 观察三氧化二砷(ATO)对人关节成纤维样滑膜细胞(FLSs)生长的影响,探讨ATO对类风湿关节炎(KA)的潜在治疗作用。方法 原代培养人关节FLSs,传至第3-5代时,以不同浓度的ATO处理细胞,通过ELISA对上清液中的TNF-a、IL-1水平进行检测,采用MTT法检测不同处理组细胞生长情况。结果 不同浓度的ATO处理后,ELISA结果显示试验各组TNF-d、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05),MTT结果显示随药物浓度增加和处理时间延长,抑制作用增强。结论 ATO可抑制人FLSs生长,并可发挥抑制滑膜细胞分泌的功效,进而对RA炎性、免疫过程产生干预作用,提示可作为治疗RA的潜在药物。

    关键词:三氧化二砷;成纤维样滑膜细胞;类风湿关节炎

    类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病,其发病机制在目前临床研究中尚未形成统一认知,但既往大量报道中均提示关节滑膜的异常增殖反应在骨组织、软骨组织的侵袭与破坏中有着非常重要的作用,这一机制提示三氧化二砷(arsemic trioxide,ATO)可能通过抑制细胞增殖,加速细胞凋亡的方式发挥对RA疾病的治疗效果。研究。引显示人成纤维样滑膜细胞(6broblast-like synoviocytes,FLSs)的过度增生和分泌在RA的发病和发展中具有重要作用。本研究通过观察ATO对人FLSs生长的影响,探讨ATO是否对RA具有潜在的治疗作用。
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    1.资料与方法

    1.1一般资料 采集2015年5月-2015年11月在我院风湿科住院的RA患者的关节积液4例(男1例,女3例,41-67岁,平均年龄55.4岁),体外原代培养人FLSs。三氧化二砷(ATO)(10 mg/瓶,购自哈尔滨制药有限公司);ELISA试剂盒(南京凯基生物科技發展有限公司)

    1.2方法

    1.2.1人FLSs培养,方法参照文献。4例患者的关节滑液经处理后均成功获得大量成纤维样细胞,经鉴定该细胞为CD68阴性细胞,即FLSs。倒置显微镜观察细胞生长情况,取第3-5代细胞用于实验。

    1.2.2 ELISA检测 将滑膜细胞按1x10个/孔接种于6孔板中,每个标本的细胞接种4孔,每孔1组,培养24 h,按照A-TO终浓度0 umol/L、0.5 umol/L、2.0 umol/L和8.0 umol/L加入相应培养孔中继续培养。4孔分别为对照组(0 umol/L)、试验1组(0.5 umol/L)、试验2组(2.0 umo]/L)和试验3组(8.0umol/L)。将反应24 h后的上清液取出,并通过ELISA法对上清液中TNF-a、IL-1水平进行检测。
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    1.2.3 MTT检测 将滑膜细胞按5x10个,孔接种于96孔板中,每个标本的细胞接种24孔,6孔1组,培养24 h,每组加入相应药物浓度与前述完全一致,另设空白(只加培养液)组6孔。培养1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后,吸去原培养液,每孔加200ul无血清H-DMEM培养液及20ul的MTr(5mg/ml),继续培养4 h。小心弃上清,每孔加入150 ul DMSO,混匀10min后,在酶标仪上测定各孔490 nm处的吸光度A值,最后计算细胞抑制率。

    1.3观察指标 对比对照组、试验各组细胞TNF-a、IL-1的检出水平差异,并观察各组ATO对人FLSs的生长状况。

    1.4统计学处理 用SPSS 19.0统计软件进行数据处理,计量资料表示为(x±s),用t检验;计数资料表示为[n(%)],用x2检验,P<0.05时为差异具有统计学意义。

    2.结果
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    2.1 ELISA结果 试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05);试验3组TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验2组、1组(P<0.05);试验2 TNF-a、IL-1检出水平显著低于试验1组(P<0.05),见表1。

    2.2 MTT结果对照组细胞生长良好,观察第1-2 d对照组与试验各组对比无明显差异(P>0.05);第3 d开始,试验各组活细胞数显著低于对照组(P<0.05),且浓度越高,作用剂量依赖性越显著,见图1。

    3.讨论

    RA是目前临床上比较常见的一种自身免疫性疾病,其病因尚未明确。研究表明,FLSs过度增生和分泌是RA发病的重要基础,参与关节的炎症发展和关节破坏。FLSs可表现出转化细胞的特征,呈类肿瘤细胞样异常增殖,侵入到软骨和软骨下的骨质,并产生炎性介质、促炎症细胞因子及抗炎症细胞因子、分泌基质金属蛋白酶等。TNF-a以及IL-1是RA发生、发展过程中重要的炎症因子,抑制FLSs的增殖和活化是目前研究RA的热点,可能为临床上治疗RA提供新的思路或靶点。
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    ATO是传统中药砒石的主要成分,对K562、NB4等肿瘤细胞的增殖有抑制作用,FLSs具有肿瘤细胞样异常增殖的特性,故本研究拟探讨ATO是否能影响人FLSs的生长,不同浓度的ATO处理FLSs后。ELISA结果:试验各组TNF-a、IL-1检出水平均显著低于对照组(P<0.05);MTT显示:细胞生长均受到不同程度的抑制,随药物浓度增加,抑制效果增强。与对照组细胞的吸光度A值比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示ATO能抑制人FLSs的增殖。

    滑膜增生是RA的特征性病理表现,增生的滑膜可形成血管翳依附于软骨表面,介导骨和软骨的破坏,FLSs凋亡不足与滑膜增生有关。介导FLSs凋亡可能是治疗RA的有效途径。本研究通过ELISA和MTT检测ATO可以有效抑制人FLSs中TNF-a、IL-1的水平,对炎症以及免疫反应产生抑制效果,ATO能够促进人FLSs的凋亡,对人FLSs增殖反应抑制效果确切,通过影响细胞内活性氧类物质代谢的方式加速细胞凋亡,进而发挥治疗效果。细胞凋亡是一个复杂的、严格受多基因调控的主动细胞死亡过程。因此,关于ATO通过怎样的途径诱导人FLSs凋亡还需要进一步研究。总之,ATO能影响人FLSs的生长,可作为治疗RA的潜在药物。, http://www.100md.com(蒋红 贾艾敏 刘琬椿等)