维吾尔族患者腰椎间盘组织中IL—6的含量及临床相关性(2)
1.2主要试剂 ELISA试剂盒均购自上海森雄科技实业有限公司，细胞裂解液购自Solarbio公司(Beijing Solarbio Science&Technology Co.Ltd代理)。
1.3实验方法
1.3.1标本制备 所有病例组和对照组椎间盘组织在术中取出后即用磷酸盐缓冲液(0.01%PBS)反复冲洗，洗净沾染的血液后，投入到液氮中保存。标本收集完毕后，由专人进行实验。
1.3.2实验过程 标本(共40份)取出，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6含量。主要方法及过程：将40份标本称重取200 mg(图2)，加入细胞裂解液RIPA2 ml，PMSF20 ul，匀浆，离心5000 r/min×10 min 4℃，取上清液(图3)，由受培训的专业人员统一进行检测，实验步骤按照药盒说明书进行。
1.4统计学方法 应用PEMS 3.1医学统计软件进行统计学数据分析，以P<0.05表示统计学上差异有显著性意义。对对照组与病例组IL-6的含量做t检验；病例组的IL-6的含量水平与患者病程及JOA评分分别进行直线相关性研究。
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2结果
2.1在病例组与对照组腰椎间盘组织中IL-6的含量(pg/mL)差异有统计学意义(IL-6：P=0.009，P<0.01)，病例组明显高于对照组(见图1)
IL-6的含量(pg/mL)差异示意图
2.2突出性和脱出型患者椎间盘组织中IL-6的含量(pg/mL)有差异 根据手术当中肉眼所见将病例组与对照组患者进行病理分型其，其中病例组中不同病理分型中细胞因子含量不同，见图2。病例组脱出型患者椎间盘组织中IL-6含量要高于突出型，t检验结果示有统计学意义(α=0.05水准，t=3.0322，P=0.0052，P<0.01)，见表1。
2.3通过直线相关性分析可得出 IL-6和患者病程相关系数：r=-0.53，P=0.0026，按a=0.05水准，可认为患者IL-6的含量水平与患者病程长短呈负相关，有统计学意义(P<0.01)，见图3。IL-6和患者JOA评分相关系数：r=-0.790，P=0.0002，按a=0.01水准，可认为患者IL-6的含量水平与患者JOA评分呈负相关，有统计学意义(P<0.01)，见图4。患者病程和患者JOA评分相关系数：r=0.449，P=0.013，按a=0.05水准，可认为患者病程与患者JOA评分呈正相关，有统计学意义(P<0.05)，见图5。
, 百拇医药
3讨论
脊柱依靠椎间盘、关节突关节、前后纵韧带、黄韧带、棘上、棘间韧带、横突间韧带等将各脊椎连接而成。由于椎间盘变性，纤维环破裂，髓核突出刺激或压迫神经根、马尾神经，进而在临床上出现腰腿疼痛、小腿及足背外侧感觉麻木等一系列症状。腰椎间盘突出症是腰腿痛最重要的原因之一，而腰椎间盘退行性变是导致腰椎间盘突出症的基本病因[4-5]。据统计，腰椎间盘突出症约占脊椎椎间盘突出症的80%～90%。椎间盘的退变是从椎间盘细胞开始的[6]。椎间盘退变后，髓核内的蛋白多糖逐渐减少，含水量不断下降，关节面的应力结构受损并影响脊柱其他结构，最终引起脊柱退变。椎间盘的退变是脊柱退变的核心环节，这一过程不仅仅表现为形态上的变化，更伴随着椎间盘的组织学与生化性质的系统性改变，如胶原类型的转换、各种降解酶的升高以及炎性介质的释放等。这一系列的变化构成了椎间盘源性腰腿痛及相应神经根病变的物质基础。从生物力学方面，一般认为由于人体直立行走的姿势，脊柱特别是下腰椎(L4～5椎体)及骶椎承受纵向的压应力、剪力、张应力以及弯曲和旋转的力量较大，故该处椎间盘突出多见。国外学者统计表明L4～5、L5～S1突出占91.52%，本研究病例组L4/5突出15例，L5/S1突出13例，占总数的93.3%，与国外文献报道基本一致。本研究病例组30例患者，平均病程为11.8个月，年龄≤40岁患者共11例，其平均病程为11.9个月，这提示患者年龄与病程之间无明显关系，患者病史长病程反复的患者不一定其发病年龄大。Takahashi[7]在突出腰椎间盘组织中发现了IL-6表达阳性细胞，但缺少正常对照。再选取对照组时，本研究由受培训的人员对死亡人员家属及法医进行询问，明确患者为非腰椎源性疾病死亡。并在手术当中再次肉眼直视下明确取材部位无椎间盘突出。
, 百拇医药
白介素由多种细胞合成分泌，其中最重要的是活化的单核-巨噬细胞，突出的椎间盘组织可引起以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润。IL-6是白介素家族中重要的细胞因子，是来源广泛的多功能因子，也是体内复杂的细胞因子网络中的关键成员，具有重要的生物学功能。可在突出的椎间盘产生免疫炎性反应，引起化学性神经根炎和神经根疼痛的作用是不可忽视的。腰椎间盘细胞具有潜在的合成能引起自身基质破坏及激发炎症反应的能力，细胞因子来源于椎间盘组织周围浸润的炎性细胞及椎间盘自身椎间盘，是由多种细胞分泌的具有多种活性的小分子可溶性蛋白质。IL-6等炎症因子在退行性骨关节病中的引起关节破坏和引起炎症反应的作用已被证实，在腰椎间盘退变过程中IL-6具有类似作用，在神经根周围可由巨噬细胞等释放多种细胞因子，其中IL-6可由纤维母细胞、软骨细胞产生，能促进细胞浸润引起炎症和组织损伤，可增加其它致痛物质如白三烯等敏感性。Kang等研究[8]发现IL-6，能够诱导组織细胞产生PGE2。本研究采用的评分标准为临床常用的日本骨科学会腰椎功能评分标准(JOA)，分3个部分：下腰痛的主观症状评分、骨科临床体征和日常活动受限情况评分，每一个项目分三种情况给分，其分值越大说明腰椎功能越好。故本研究针对患者临床上出现的下腰痛症状及体征，术前由一名受培训的医师进行详细病史询问，明确病程长短，对术前临床症状、体征等均给予JOA评定。发现JOA评分>11分的患者其病程平均为12.6月，JOA评分≤11分的患者其病程平均为10.8月。对术前JOA评分及患者病程进行相关性研究发现：r=0.449，P=0.013，可认为患者病程与患者JOA评分呈正相关，有统计学意义(P<0.05)。这提示术前病程长短与患者手术前下腰痛引起的腰椎功能情况变化有相关性。此结果可以进一步说明，临床上腰腿痛病程长的腰椎间盘突出症患者可能会表现出更多腰椎功能受损情况。本研究还发现患者IL-6含量和患者JOA评分呈负相关，与患者病程长短呈负相关，有统计学意义(P<0.01)。这说明患者主观症状、骨科临床体征和日常活动受损情况越重，突出的椎间盘引起的炎症反应越重，其表达含量就越大。同样可以解释在短期内急性发作患者其病情短，腰椎功能受损严重，JOA评分越低其突出椎间盘组织周围炎性因子引起的致炎反应就越重，局部IL-6含量越高。本研究中病例组患者中JOA评分<11分(平均11.6分)患者8例，其平均评分为6分，其IL-6值为0.194，偏高(平均为0.174)，患者平均病程为6.3个月(平均为11.8个月)。这8例患者中3例患者在手术中证实其突出类型为：脱出型。5例脱出型患者IL-6值为0.193，要明显高于突出型患者，有统计学意义(P<0.01)。患者平均病程为7.6个月，JOA平均评分为8.8分。维吾尔族是一个多源民族，主要生活在新疆，总人口达987万人左右，在人种学上尤其自己的独特性[9]，目前国内关于维吾尔族腰椎间盘内炎性指标的研究尚属空白，本研究通过获得基本数据来与对照组进行研究，样本数较少需要进一步大样本量研究来探讨民族间的差异性。, 百拇医药(旭合热提·吾提库尔哈巴西·卡肯 袁宏)
1.3实验方法
1.3.1标本制备 所有病例组和对照组椎间盘组织在术中取出后即用磷酸盐缓冲液(0.01%PBS)反复冲洗，洗净沾染的血液后，投入到液氮中保存。标本收集完毕后，由专人进行实验。
1.3.2实验过程 标本(共40份)取出，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6含量。主要方法及过程：将40份标本称重取200 mg(图2)，加入细胞裂解液RIPA2 ml，PMSF20 ul，匀浆，离心5000 r/min×10 min 4℃，取上清液(图3)，由受培训的专业人员统一进行检测，实验步骤按照药盒说明书进行。
1.4统计学方法 应用PEMS 3.1医学统计软件进行统计学数据分析，以P<0.05表示统计学上差异有显著性意义。对对照组与病例组IL-6的含量做t检验；病例组的IL-6的含量水平与患者病程及JOA评分分别进行直线相关性研究。
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2结果
2.1在病例组与对照组腰椎间盘组织中IL-6的含量(pg/mL)差异有统计学意义(IL-6：P=0.009，P<0.01)，病例组明显高于对照组(见图1)
IL-6的含量(pg/mL)差异示意图
2.2突出性和脱出型患者椎间盘组织中IL-6的含量(pg/mL)有差异 根据手术当中肉眼所见将病例组与对照组患者进行病理分型其，其中病例组中不同病理分型中细胞因子含量不同，见图2。病例组脱出型患者椎间盘组织中IL-6含量要高于突出型，t检验结果示有统计学意义(α=0.05水准，t=3.0322，P=0.0052，P<0.01)，见表1。
2.3通过直线相关性分析可得出 IL-6和患者病程相关系数：r=-0.53，P=0.0026，按a=0.05水准，可认为患者IL-6的含量水平与患者病程长短呈负相关，有统计学意义(P<0.01)，见图3。IL-6和患者JOA评分相关系数：r=-0.790，P=0.0002，按a=0.01水准，可认为患者IL-6的含量水平与患者JOA评分呈负相关，有统计学意义(P<0.01)，见图4。患者病程和患者JOA评分相关系数：r=0.449，P=0.013，按a=0.05水准，可认为患者病程与患者JOA评分呈正相关，有统计学意义(P<0.05)，见图5。
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3讨论
脊柱依靠椎间盘、关节突关节、前后纵韧带、黄韧带、棘上、棘间韧带、横突间韧带等将各脊椎连接而成。由于椎间盘变性，纤维环破裂，髓核突出刺激或压迫神经根、马尾神经，进而在临床上出现腰腿疼痛、小腿及足背外侧感觉麻木等一系列症状。腰椎间盘突出症是腰腿痛最重要的原因之一，而腰椎间盘退行性变是导致腰椎间盘突出症的基本病因[4-5]。据统计，腰椎间盘突出症约占脊椎椎间盘突出症的80%～90%。椎间盘的退变是从椎间盘细胞开始的[6]。椎间盘退变后，髓核内的蛋白多糖逐渐减少，含水量不断下降，关节面的应力结构受损并影响脊柱其他结构，最终引起脊柱退变。椎间盘的退变是脊柱退变的核心环节，这一过程不仅仅表现为形态上的变化，更伴随着椎间盘的组织学与生化性质的系统性改变，如胶原类型的转换、各种降解酶的升高以及炎性介质的释放等。这一系列的变化构成了椎间盘源性腰腿痛及相应神经根病变的物质基础。从生物力学方面，一般认为由于人体直立行走的姿势，脊柱特别是下腰椎(L4～5椎体)及骶椎承受纵向的压应力、剪力、张应力以及弯曲和旋转的力量较大，故该处椎间盘突出多见。国外学者统计表明L4～5、L5～S1突出占91.52%，本研究病例组L4/5突出15例，L5/S1突出13例，占总数的93.3%，与国外文献报道基本一致。本研究病例组30例患者，平均病程为11.8个月，年龄≤40岁患者共11例，其平均病程为11.9个月，这提示患者年龄与病程之间无明显关系，患者病史长病程反复的患者不一定其发病年龄大。Takahashi[7]在突出腰椎间盘组织中发现了IL-6表达阳性细胞，但缺少正常对照。再选取对照组时，本研究由受培训的人员对死亡人员家属及法医进行询问，明确患者为非腰椎源性疾病死亡。并在手术当中再次肉眼直视下明确取材部位无椎间盘突出。
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白介素由多种细胞合成分泌，其中最重要的是活化的单核-巨噬细胞，突出的椎间盘组织可引起以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润。IL-6是白介素家族中重要的细胞因子，是来源广泛的多功能因子，也是体内复杂的细胞因子网络中的关键成员，具有重要的生物学功能。可在突出的椎间盘产生免疫炎性反应，引起化学性神经根炎和神经根疼痛的作用是不可忽视的。腰椎间盘细胞具有潜在的合成能引起自身基质破坏及激发炎症反应的能力，细胞因子来源于椎间盘组织周围浸润的炎性细胞及椎间盘自身椎间盘，是由多种细胞分泌的具有多种活性的小分子可溶性蛋白质。IL-6等炎症因子在退行性骨关节病中的引起关节破坏和引起炎症反应的作用已被证实，在腰椎间盘退变过程中IL-6具有类似作用，在神经根周围可由巨噬细胞等释放多种细胞因子，其中IL-6可由纤维母细胞、软骨细胞产生，能促进细胞浸润引起炎症和组织损伤，可增加其它致痛物质如白三烯等敏感性。Kang等研究[8]发现IL-6，能够诱导组織细胞产生PGE2。本研究采用的评分标准为临床常用的日本骨科学会腰椎功能评分标准(JOA)，分3个部分：下腰痛的主观症状评分、骨科临床体征和日常活动受限情况评分，每一个项目分三种情况给分，其分值越大说明腰椎功能越好。故本研究针对患者临床上出现的下腰痛症状及体征，术前由一名受培训的医师进行详细病史询问，明确病程长短，对术前临床症状、体征等均给予JOA评定。发现JOA评分>11分的患者其病程平均为12.6月，JOA评分≤11分的患者其病程平均为10.8月。对术前JOA评分及患者病程进行相关性研究发现：r=0.449，P=0.013，可认为患者病程与患者JOA评分呈正相关，有统计学意义(P<0.05)。这提示术前病程长短与患者手术前下腰痛引起的腰椎功能情况变化有相关性。此结果可以进一步说明，临床上腰腿痛病程长的腰椎间盘突出症患者可能会表现出更多腰椎功能受损情况。本研究还发现患者IL-6含量和患者JOA评分呈负相关，与患者病程长短呈负相关，有统计学意义(P<0.01)。这说明患者主观症状、骨科临床体征和日常活动受损情况越重，突出的椎间盘引起的炎症反应越重，其表达含量就越大。同样可以解释在短期内急性发作患者其病情短，腰椎功能受损严重，JOA评分越低其突出椎间盘组织周围炎性因子引起的致炎反应就越重，局部IL-6含量越高。本研究中病例组患者中JOA评分<11分(平均11.6分)患者8例，其平均评分为6分，其IL-6值为0.194，偏高(平均为0.174)，患者平均病程为6.3个月(平均为11.8个月)。这8例患者中3例患者在手术中证实其突出类型为：脱出型。5例脱出型患者IL-6值为0.193，要明显高于突出型患者，有统计学意义(P<0.01)。患者平均病程为7.6个月，JOA平均评分为8.8分。维吾尔族是一个多源民族，主要生活在新疆，总人口达987万人左右，在人种学上尤其自己的独特性[9]，目前国内关于维吾尔族腰椎间盘内炎性指标的研究尚属空白，本研究通过获得基本数据来与对照组进行研究，样本数较少需要进一步大样本量研究来探讨民族间的差异性。, 百拇医药(旭合热提·吾提库尔哈巴西·卡肯 袁宏)