母婴分离对新生期大鼠成年后海马组织激肽释放酶8的影响(2)
1 资料与方法
1.1一般资料 我们采用3月健康Wistar大鼠(由西南医科大学实验动物中心提供)，其中雄性5只，雌性10只，均未进行交配，在西南医科大学实验室动物房饲养，大鼠可以自由饮水和进食。体重为190～300 g，按雌雄2∶1合笼成功交配后，取出孕鼠，单独喂养。孕鼠生产后，将一只哺乳期大鼠和12只新生鼠同笼喂养。
1.2 主要实验试剂 激肽释放酶-8抗体 bs-5871R Rb a KlK8：北京博奥森生物技术有限公司，中国；SP免疫组化试剂盒： 北京博奥森生物技术有限公司，中国。
1.3方法
1.3.1模型建立及实验分组[9] 取新生Wistar大鼠24只，分组为对照组，分离组两组，12只为一组，其中将分离组的大鼠在出生后的第2 d与哺乳母鼠分离，3 h/d，3 h后将新生的Wistar大鼠送回笼中与哺乳母鼠相聚，总共21 d，对照组大鼠与母鼠同笼。正常喂养。
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2.2灌注固定和取材 大鼠出生8 w后取材，麻醉后断头处死，手术取出脑组织，经过固定，脱水，浸透，包埋，取冠状位海马切片，HE染色，2.4结果分析 切片中包浆中以出现棕黄色颗粒可视为阳性，在Olympus光镜下(10×40)，用图文拍照软件将每张切片取5个不同视野拍照。采用Image-Pro Plus(IPP)6.0图象分析体系对所拍摄的图象做半定量分析，测定免疫反应产物KLK8的平均吸光度值(average optical density.AOD)，取平均值，作为此片的光密度值，进行统计分析。
2.5统计学分析处理 采用SPSS 16.0 软件对数据进行分析，将所有计量资料表示采用均数±标准差(x±s)，用单因素方差比较分析，t检验进行组间比较，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
检测出经过新生期母婴分离后的大鼠海马组织KLK8的表达水平 阳性标准为：棕黄色产物，呈颗粒状，KLK8主要在海马神经元细胞内进行表达。经过NMS的Wistar大鼠在成年以后，KLK8表达水平与对照组相比明显降低(P<0.01)，差异具有统计学意义，见表1，图1。
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3 讨论
有报道称电生理和行为研究中发现组织KLK8影响海马的重塑[10]，KLK8是激肽释放酶家族的重要成员，属于丝氨酸蛋白酶，KLK8广泛存在于组织和体液中，在脑和皮肤、乳腺、卵巢等中都检测出了它的分泌水平，特别是，在脑海马中高表达，和学习记忆，神经发育相关。它可以通过参与E-LTP，参与降解L1和影响胞外蛋白酶来参与海马突触重塑。
本试验中证明新生期母婴分离会使大鼠海马中KLK8分泌水平下降，该变化会影响海马突触的重塑，并影响神经元的功能，从而影响大鼠的记忆和认知功能。
结论母婴分离后的Wistar大鼠，KLK8在海马中的表达量一直低于未进行母婴分离的对照组，KLK8表达的下降可能导致大鼠记忆和认知障碍。
参考文献：
[1]Pryce CR，Rüedi-Bettschen D，Dettling AC，et al. Long-term effects of early-life environmental manipulations in rodents and primates：Potential animal models in depression research [J].Neurosci Biobehav Rev，2005，29(4-5)：649-674.
, 百拇医药
[2]Zola S M， Squire L R， Teng E， et al. Impaired recognition memory in monkeys after damage limited to the region[J].hippocampal. Neurosci，2000，20(1)：451-446. .
[3]黄文伟，周福生.肠易激综合征发病机制研究新进展[J].广州中医药大学学报，2006(1)：21-26.
[4]Zhang XJ，Li Z，Chung EK，et al.Activation ot extracellular Klk8 regulated protein kinase is associated with colorectal distension-induced spinal and supraspinal neuronal response and neonatal maternal separation-induced visceral hyperalgesia in rats.[J].Mol Neurosci，2009，(37) 274-287.
, 百拇医药
[5]孫鸿燕，朱小霞，等.新生期母婴分离对大鼠成年后行为的影响及机制[J].中国妇幼健康研究，2011，26(19)：2984-2986.
[6]杨燕珍，吴斌.新生鼠母婴分离对心理行为的影响及相关机制[J].中国妇幼健康研究，2008，(19)：479-481.
[7]Mark R.Darling Sam Tsai Linda Jackson-Boeters，et al.Human Kallikrein 8 Expression in Salivary[J].Gland Tumors ，2008，2(3)：169-174.
[8]Ishikawa Y.et al.Neuropsin(KLK8)-dependent and-independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus[J].Neurosci，2008，28：843-849.
[9]Peter Goettig Viktor Magdolen Hans Brandstetter et al.Natural and synthetic inhibitors of kallikrein-related peptidases Biochimie[J]. Nov 2010，92(11)： 1546-1567.
[10]Diamandis EP，Yousef GM.Human tissue kallikreins a family of new cancerbiomarkers[J].Clin Chem，2002，48(8)：1198-1205.
编辑/张燕, http://www.100md.com(张璐 董文斌)
1.1一般资料 我们采用3月健康Wistar大鼠(由西南医科大学实验动物中心提供)，其中雄性5只，雌性10只，均未进行交配，在西南医科大学实验室动物房饲养，大鼠可以自由饮水和进食。体重为190～300 g，按雌雄2∶1合笼成功交配后，取出孕鼠，单独喂养。孕鼠生产后，将一只哺乳期大鼠和12只新生鼠同笼喂养。
1.2 主要实验试剂 激肽释放酶-8抗体 bs-5871R Rb a KlK8：北京博奥森生物技术有限公司，中国；SP免疫组化试剂盒： 北京博奥森生物技术有限公司，中国。
1.3方法
1.3.1模型建立及实验分组[9] 取新生Wistar大鼠24只，分组为对照组，分离组两组，12只为一组，其中将分离组的大鼠在出生后的第2 d与哺乳母鼠分离，3 h/d，3 h后将新生的Wistar大鼠送回笼中与哺乳母鼠相聚，总共21 d，对照组大鼠与母鼠同笼。正常喂养。
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2.2灌注固定和取材 大鼠出生8 w后取材，麻醉后断头处死，手术取出脑组织，经过固定，脱水，浸透，包埋，取冠状位海马切片，HE染色，2.4结果分析 切片中包浆中以出现棕黄色颗粒可视为阳性，在Olympus光镜下(10×40)，用图文拍照软件将每张切片取5个不同视野拍照。采用Image-Pro Plus(IPP)6.0图象分析体系对所拍摄的图象做半定量分析，测定免疫反应产物KLK8的平均吸光度值(average optical density.AOD)，取平均值，作为此片的光密度值，进行统计分析。
2.5统计学分析处理 采用SPSS 16.0 软件对数据进行分析，将所有计量资料表示采用均数±标准差(x±s)，用单因素方差比较分析，t检验进行组间比较，P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
检测出经过新生期母婴分离后的大鼠海马组织KLK8的表达水平 阳性标准为：棕黄色产物，呈颗粒状，KLK8主要在海马神经元细胞内进行表达。经过NMS的Wistar大鼠在成年以后，KLK8表达水平与对照组相比明显降低(P<0.01)，差异具有统计学意义，见表1，图1。
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3 讨论
有报道称电生理和行为研究中发现组织KLK8影响海马的重塑[10]，KLK8是激肽释放酶家族的重要成员，属于丝氨酸蛋白酶，KLK8广泛存在于组织和体液中，在脑和皮肤、乳腺、卵巢等中都检测出了它的分泌水平，特别是，在脑海马中高表达，和学习记忆，神经发育相关。它可以通过参与E-LTP，参与降解L1和影响胞外蛋白酶来参与海马突触重塑。
本试验中证明新生期母婴分离会使大鼠海马中KLK8分泌水平下降，该变化会影响海马突触的重塑，并影响神经元的功能，从而影响大鼠的记忆和认知功能。
结论母婴分离后的Wistar大鼠，KLK8在海马中的表达量一直低于未进行母婴分离的对照组，KLK8表达的下降可能导致大鼠记忆和认知障碍。
参考文献：
[1]Pryce CR，Rüedi-Bettschen D，Dettling AC，et al. Long-term effects of early-life environmental manipulations in rodents and primates：Potential animal models in depression research [J].Neurosci Biobehav Rev，2005，29(4-5)：649-674.
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[2]Zola S M， Squire L R， Teng E， et al. Impaired recognition memory in monkeys after damage limited to the region[J].hippocampal. Neurosci，2000，20(1)：451-446. .
[3]黄文伟，周福生.肠易激综合征发病机制研究新进展[J].广州中医药大学学报，2006(1)：21-26.
[4]Zhang XJ，Li Z，Chung EK，et al.Activation ot extracellular Klk8 regulated protein kinase is associated with colorectal distension-induced spinal and supraspinal neuronal response and neonatal maternal separation-induced visceral hyperalgesia in rats.[J].Mol Neurosci，2009，(37) 274-287.
, 百拇医药
[5]孫鸿燕，朱小霞，等.新生期母婴分离对大鼠成年后行为的影响及机制[J].中国妇幼健康研究，2011，26(19)：2984-2986.
[6]杨燕珍，吴斌.新生鼠母婴分离对心理行为的影响及相关机制[J].中国妇幼健康研究，2008，(19)：479-481.
[7]Mark R.Darling Sam Tsai Linda Jackson-Boeters，et al.Human Kallikrein 8 Expression in Salivary[J].Gland Tumors ，2008，2(3)：169-174.
[8]Ishikawa Y.et al.Neuropsin(KLK8)-dependent and-independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus[J].Neurosci，2008，28：843-849.
[9]Peter Goettig Viktor Magdolen Hans Brandstetter et al.Natural and synthetic inhibitors of kallikrein-related peptidases Biochimie[J]. Nov 2010，92(11)： 1546-1567.
[10]Diamandis EP，Yousef GM.Human tissue kallikreins a family of new cancerbiomarkers[J].Clin Chem，2002，48(8)：1198-1205.
编辑/张燕, http://www.100md.com(张璐 董文斌)