热性惊厥患儿人类疱疹病毒6型感染的检测分析(2)
采用巢氏PCR法检测所有样本中HHV-6 DNA。试剂盒提取血清及CSF中HHV-6 DNA，置-20℃备用，根据HHV-6大衣壳蛋白基因(LTP gene)的DNA序列设计一对外引物和一对内引物，各引物序列，见表1。外(内)引物PCR反应体系为：上游引物10 μmol，下游引物10 μmol，Taq DNA聚合酶 1U，dNTP 20 mmol，Mgcl2 30 mmol，10×PCR Buffer 2.5 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O补足至20 μl。外引物、内引物PCR的反应参数均为：94℃预变性5 min；(94℃ 35 s，55℃ 45 s ，72℃ 55s)，共35个循环；72℃总延伸8min，取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，见表1。
1.2.3统计学方法 采用EXECL2003和SPSS16.0软件进行数据收集和处理。
2结果
2.1间接免疫荧光法 热性惊厥患儿血清HHV-6 IgM阳性率为17.00%(9/53)，IgG阳性率为66.00%(35/53)；脑脊液HHV-6 IgM和IgG均未检出阳性。
, 百拇医药
2.2巢氏PCR法 取10 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，90V 30 min，凝胶成像系统观察电泳条带并拍照，外引物PCR产物片段为287 bp，内引物PCR产物片段为163 bp，见图1。
53例血清中，巢氏PCR阳性10例，阳性率为18.9%，其中8例年龄在1岁以下，10例中有7例的间接免疫荧光法结果为阳性，提示巢氏PCR法敏感性高于间接免疫荧光法。95例脑脊液样本均未扩增出HHV-6 DNA。
3讨论
儿童热性惊厥的发病机制尚不明确，可能与遗传、感染、免疫、发热等有关。首次热性惊厥患儿年龄在2个月～6岁，发病高峰期是1～2岁，呼吸道感染、幼儿急诊、急性中耳炎与热性惊厥的发生有关，孙冬青等报道94.70%的首次热性惊厥患儿患有呼吸道感染或幼儿急疹，首次热性惊厥患儿与HHV-6感染合并率为34.7%[4]，本研究在18.90%的热性惊厥患儿中扩增出了HHV-6 DNA，其中的大部分患儿都<1岁，提示HHV-6感染与热性惊厥的发生相关，如果<1岁的儿童首次发生热性惊厥时，应考虑到HHV-6感染。
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国外一些研究也证实HHV-6有噬神经的特点，但大部分热性惊厥患儿只能从血液中查到HHV-6，在脑脊液中很难检出HHV-6 DNA[5]，也有在脑脊液中检出HHV-6 DNA的报道，如Kondo等对仅有一次热性痉挛发作的患儿脑脊液进行检测，HHV-6 DNA都为阴性[6]，但幼儿急疹患病后热性痉挛反复发作3次以上者，脑脊液中HHV-6 DNA检出率很高，据此他推测HHV-6在原发感染后形成潜伏感染，反复的热性惊厥可能与潜伏的HHV-6被激活有关[7]。本研究结果显示，热性惊厥与HHV-6感染有相关性，但仅在部分热性惊厥病例血清中查出HHV-6 IgM抗体或HHV-6 DNA，在滴度为1：10时95例热性惊厥患儿脑脊液IgG抗体均为阴性，且通过巢氏PCR检测所有脑脊液中均未扩增出HHV-6 DNA，因此本研究未能证实HHV-6的噬神经特点，有待加大样本量进一步深入研究。
参考文献：
[1]Joshua A.hill，Nagagopal venna.Human herpesvirus 6 and the nervous system [J].Handbook of Clinical Neurology，2014，123(2)：327-355.
, 百拇医药
[2]D.A.Clark.Clinical and laboratory features of human herpesvirus 6 chromosomalintegration [J].Clin Microbiol Infect，2016，22：333-339.
[3]Shiho Yamamoto，Satoru Takahashi，Ryosuke Tanaka，et al.Human herpesvirus-6 infection-associated acute encephalopathy without skin rash [J].Brain and Development，2015，37：829-832.
[4]張冬青，孙若鹏.首次热性惊厥与人疱疹病毒6型感染的关系[J].山东大学学报(医学版)，2008，46(2)：185-187.
[5]Joshua A.Hill，Michael J.Boeckh，Ruth Hall Sedlak，et al.Human herpesvirus 6 can be detected in cerebrospinaluid without associated symptoms after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J].Journal of Clinical Virology，2014，61：289-292.
, 百拇医药
[6]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Association of HHV-6 infection of the central nervous system with recurrence of febrile convulsions[J].J lnfect Dis，1993，167：1197-1200.
[7]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Prevalence of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus 6 in Patients with Human Herpesvirus 6 Central Nervous System Dysfunction[J].Biol Blood Marrow Transplant，2015，21：364-381.
编辑/李桦, 百拇医药(孙岩 王锋 于静 马兰红 古丽比亚 余亮 罗新辉 孙荷)
1.2.3统计学方法 采用EXECL2003和SPSS16.0软件进行数据收集和处理。
2结果
2.1间接免疫荧光法 热性惊厥患儿血清HHV-6 IgM阳性率为17.00%(9/53)，IgG阳性率为66.00%(35/53)；脑脊液HHV-6 IgM和IgG均未检出阳性。
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2.2巢氏PCR法 取10 μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，90V 30 min，凝胶成像系统观察电泳条带并拍照，外引物PCR产物片段为287 bp，内引物PCR产物片段为163 bp，见图1。
53例血清中，巢氏PCR阳性10例，阳性率为18.9%，其中8例年龄在1岁以下，10例中有7例的间接免疫荧光法结果为阳性，提示巢氏PCR法敏感性高于间接免疫荧光法。95例脑脊液样本均未扩增出HHV-6 DNA。
3讨论
儿童热性惊厥的发病机制尚不明确，可能与遗传、感染、免疫、发热等有关。首次热性惊厥患儿年龄在2个月～6岁，发病高峰期是1～2岁，呼吸道感染、幼儿急诊、急性中耳炎与热性惊厥的发生有关，孙冬青等报道94.70%的首次热性惊厥患儿患有呼吸道感染或幼儿急疹，首次热性惊厥患儿与HHV-6感染合并率为34.7%[4]，本研究在18.90%的热性惊厥患儿中扩增出了HHV-6 DNA，其中的大部分患儿都<1岁，提示HHV-6感染与热性惊厥的发生相关，如果<1岁的儿童首次发生热性惊厥时，应考虑到HHV-6感染。
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国外一些研究也证实HHV-6有噬神经的特点，但大部分热性惊厥患儿只能从血液中查到HHV-6，在脑脊液中很难检出HHV-6 DNA[5]，也有在脑脊液中检出HHV-6 DNA的报道，如Kondo等对仅有一次热性痉挛发作的患儿脑脊液进行检测，HHV-6 DNA都为阴性[6]，但幼儿急疹患病后热性痉挛反复发作3次以上者，脑脊液中HHV-6 DNA检出率很高，据此他推测HHV-6在原发感染后形成潜伏感染，反复的热性惊厥可能与潜伏的HHV-6被激活有关[7]。本研究结果显示，热性惊厥与HHV-6感染有相关性，但仅在部分热性惊厥病例血清中查出HHV-6 IgM抗体或HHV-6 DNA，在滴度为1：10时95例热性惊厥患儿脑脊液IgG抗体均为阴性，且通过巢氏PCR检测所有脑脊液中均未扩增出HHV-6 DNA，因此本研究未能证实HHV-6的噬神经特点，有待加大样本量进一步深入研究。
参考文献：
[1]Joshua A.hill，Nagagopal venna.Human herpesvirus 6 and the nervous system [J].Handbook of Clinical Neurology，2014，123(2)：327-355.
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[2]D.A.Clark.Clinical and laboratory features of human herpesvirus 6 chromosomalintegration [J].Clin Microbiol Infect，2016，22：333-339.
[3]Shiho Yamamoto，Satoru Takahashi，Ryosuke Tanaka，et al.Human herpesvirus-6 infection-associated acute encephalopathy without skin rash [J].Brain and Development，2015，37：829-832.
[4]張冬青，孙若鹏.首次热性惊厥与人疱疹病毒6型感染的关系[J].山东大学学报(医学版)，2008，46(2)：185-187.
[5]Joshua A.Hill，Michael J.Boeckh，Ruth Hall Sedlak，et al.Human herpesvirus 6 can be detected in cerebrospinaluid without associated symptoms after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J].Journal of Clinical Virology，2014，61：289-292.
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[6]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Association of HHV-6 infection of the central nervous system with recurrence of febrile convulsions[J].J lnfect Dis，1993，167：1197-1200.
[7]Kondo K，Nakafuji H，Hata A，et al.Prevalence of Chromosomally Integrated Human Herpesvirus 6 in Patients with Human Herpesvirus 6 Central Nervous System Dysfunction[J].Biol Blood Marrow Transplant，2015，21：364-381.
编辑/李桦, 百拇医药(孙岩 王锋 于静 马兰红 古丽比亚 余亮 罗新辉 孙荷)
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