阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用初步研究(2)
1.2.3 Griess法檢测NO含量 RAW 264.7细胞液接种于96孔培养板中，接种密度为1.5×104细胞/孔，贴壁生长24 h。24 h后加入阿江榄仁酸(1，5，10，20，40，80，160 μmol/L)、雷公藤红素(0.5 μmol/L)并分别加入LPS(5 μg/ml)培养24 h。培养后在40 μl/孔的细胞上清液中加入40 μl的Griess反应试剂。在570 nm下测定OD值，计算NO含量。
1.2.4 ELISA法检测TNF-α及IL-6表达量 按照试剂盒说明分别检测TNF-α及IL-6的表达水平。
1.3统计学方法
实验数据均以means±SD来表示，采用统计软件SPSS19.0和作图软件Graphpad prism 5对所得数据进行统计与处理，统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05表示存在显著性差异。
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2 结果
2.1阿江榄仁酸药物浓度的筛选
在加入LPS及不同给药浓度后，以MTT法检测阿江榄仁酸对细胞生存力的影响，结果显示阿江榄仁酸不同浓度(0，1，5，10，20，40，80，160 μmol/L)处理组无统计学差异(见图1)，表明阿江榄仁酸浓度在80 μmol/L范围内细胞生存力均>90%。
2.2阿江榄仁酸对 LPS诱导的 NO含量的影响
采用Griess法检测NO的表达量。结果表明，加入LPS后的细胞液中NO的含量显著升高，而阿江榄仁酸给药组可以使升高的NO含量降低，并与剂量呈正相关性(P<0.05)。阿江榄仁酸给药浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时，对NO的含量的抑制率可达到50%(见图2)。
2.3阿江榄仁酸对 LPS诱导的炎性细胞因子含量的影响
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采用ELISA试验检测炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达量。结果显示，加入LPS后的细胞液中TNF-α(见图3A)和IL-6(见图3B)的表达量显著升高，而阿江榄仁酸给药组能够剂量依赖性地使升高的炎性细胞因子含量降低(P<0.05)。
3 讨论
巨噬细胞是一种广泛分布在炎症中其重要作用的先天免疫细胞[8]。LPS通过其脂质成分可以作用于包括巨噬细胞在内的多种细胞，在LPS的诱导下，巨噬细胞被激活而导致炎症介质(TNF-α，IL-6)的释放[9]。因此，LPS-诱导RAW 264.7巨噬细胞产生炎症反应的模型被广泛用于抗炎药物的筛选[10]。IL-6是一个潜在的炎性细胞因子介导许多重要的生理功能，特别是急性和慢性炎症[11]。TNF参与多种细胞生理过程，包括细胞存活、细胞凋亡和坏死。在本研究中，LPS能促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平显著增加，而阿江榄仁酸可逆转由LPS引起的TNF-α和IL-6的高表达。这些结果表明，阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症具有保护作用。
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参考文献：
[1]ME Rubio-Ruiz，AE Peredo-Escárcega，A Cano-Martínez， et al.An Evolutionary Perspective of Nutrition and Inflammation as Mechanisms of Cardiovascular Disease[J].International Journal of Evolutionary Biology，2015，2015(20)：1-10.
[2]Donath MY，SE Shoelson.Type 2 diabetes as an inflammatory disease[J].Nature Reviews Immunology，2011，11(2)：98-107.
[3]聂绪强，张丹丹，张涵.炎症、胰岛素抵抗与糖尿病的中药治疗[J].中国药学杂志，2017，52(1)：1-7.
, 百拇医药
[4]阮洪生，牟晋珠.表儿茶素对脂多糖诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017，23(4)：159-163.
[5]代艳文，袁丁，万静枝，等.竹节参总皂苷通过NF-κB通路对LPS致RAW264.7细胞炎症的保护作用研究[J].中国中药杂志，2014，39(11)：2076-2080.
[6]诸夔妞，吴正凤，蒋翠花，等.三萜类化合物降血糖活性及其作用机制研究进展[J].中国药科大学学报，2015，46(6)：764-770.
[7]李娇妹，郑纺，翟丽娟，等.三萜类化合物抗肿瘤活性研究进展[J].中草药，2014，45(15)：2265-2271.
[8]Awad A S，You H，Gao T，et al.Macrophage-derived tumor necrosis factor-α mediates diabetic renal injury[J].Kidney Int，2015，88(4)：722-733.
, http://www.100md.com
[9]Xu X，Qi X，Shao Y，et al.Blockade of TGF-β-activated kinase1 prevents advanced glycation end products-induced inflammatory response in macrophages[J].Cytokine，2016(78)：62-68.
[10] T Mori，T Miyamoto，H Yoshida，et al.IL-1beta and TNFalpha-initiated IL-6-STAT3 pathway is critical in mediating inflammatory cytokines and RANKL expression in inflammatory arthritis[J].Int Immunol，2011，23(11)：701-712.
[11]DP Nguyen，J Li，AK Tewari.Inflammation and prostate cancer：the role of interleukin 6(IL-6)[J].Bju International，2014，113(6)：986-992., http://www.100md.com(权洪峰 闫欣 彭晓东)
1.2.4 ELISA法检测TNF-α及IL-6表达量 按照试剂盒说明分别检测TNF-α及IL-6的表达水平。
1.3统计学方法
实验数据均以means±SD来表示，采用统计软件SPSS19.0和作图软件Graphpad prism 5对所得数据进行统计与处理，统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05表示存在显著性差异。
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2 结果
2.1阿江榄仁酸药物浓度的筛选
在加入LPS及不同给药浓度后，以MTT法检测阿江榄仁酸对细胞生存力的影响，结果显示阿江榄仁酸不同浓度(0，1，5，10，20，40，80，160 μmol/L)处理组无统计学差异(见图1)，表明阿江榄仁酸浓度在80 μmol/L范围内细胞生存力均>90%。
2.2阿江榄仁酸对 LPS诱导的 NO含量的影响
采用Griess法检测NO的表达量。结果表明，加入LPS后的细胞液中NO的含量显著升高，而阿江榄仁酸给药组可以使升高的NO含量降低，并与剂量呈正相关性(P<0.05)。阿江榄仁酸给药浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时，对NO的含量的抑制率可达到50%(见图2)。
2.3阿江榄仁酸对 LPS诱导的炎性细胞因子含量的影响
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采用ELISA试验检测炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达量。结果显示，加入LPS后的细胞液中TNF-α(见图3A)和IL-6(见图3B)的表达量显著升高，而阿江榄仁酸给药组能够剂量依赖性地使升高的炎性细胞因子含量降低(P<0.05)。
3 讨论
巨噬细胞是一种广泛分布在炎症中其重要作用的先天免疫细胞[8]。LPS通过其脂质成分可以作用于包括巨噬细胞在内的多种细胞，在LPS的诱导下，巨噬细胞被激活而导致炎症介质(TNF-α，IL-6)的释放[9]。因此，LPS-诱导RAW 264.7巨噬细胞产生炎症反应的模型被广泛用于抗炎药物的筛选[10]。IL-6是一个潜在的炎性细胞因子介导许多重要的生理功能，特别是急性和慢性炎症[11]。TNF参与多种细胞生理过程，包括细胞存活、细胞凋亡和坏死。在本研究中，LPS能促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平显著增加，而阿江榄仁酸可逆转由LPS引起的TNF-α和IL-6的高表达。这些结果表明，阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症具有保护作用。
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参考文献：
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[3]聂绪强，张丹丹，张涵.炎症、胰岛素抵抗与糖尿病的中药治疗[J].中国药学杂志，2017，52(1)：1-7.
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[7]李娇妹，郑纺，翟丽娟，等.三萜类化合物抗肿瘤活性研究进展[J].中草药，2014，45(15)：2265-2271.
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[9]Xu X，Qi X，Shao Y，et al.Blockade of TGF-β-activated kinase1 prevents advanced glycation end products-induced inflammatory response in macrophages[J].Cytokine，2016(78)：62-68.
[10] T Mori，T Miyamoto，H Yoshida，et al.IL-1beta and TNFalpha-initiated IL-6-STAT3 pathway is critical in mediating inflammatory cytokines and RANKL expression in inflammatory arthritis[J].Int Immunol，2011，23(11)：701-712.
[11]DP Nguyen，J Li，AK Tewari.Inflammation and prostate cancer：the role of interleukin 6(IL-6)[J].Bju International，2014，113(6)：986-992., http://www.100md.com(权洪峰 闫欣 彭晓东)