转基因动物模型制作进展(2)
显微注射DNA的方法目前应用较多，是实验室真正成熟并可以稳定生产转基因动物的有效方法。但在其制作过程中仍涉及复杂的操作过程[7]。首先，在制作过程中要注意掌握母畜的性周期，使母畜在预先设定的时间内排卵，以保证获得大量刚刚受精的单细胞胚胎。其次，此种方法制作的转基因动物只能约占子代中的1%～3%，效率较低，但是结果相当稳定，并且成本较低，是目前实验室常用的一种值得推荐的方法[8]。
2精子导入法
利用雄性精子作为外源性基因，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中的方法称为精子导入法，是制作转基因动物的一种新的方法。此方法把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力，然后用携带有外源基因的精子给母畜受精，在母畜的后代中就会产生一定比例的动物是整合了外源基因的动物。该法简单、方便。与显微注射法，其成本较低，同时不涉及对动物进行手术处理，因此其操作相对简单[9-10]。但在实践过程中仍然发现这种方法成功率较低，而且对于精子是否可作为外源DNA载体也存在争论。因此目前这项技术仍处在早期探索阶段，仍需进一步实验室研究。应用此种方法可以将人工授精、体外受精与转基因结合起来。
, 百拇医药
3胚胎干细胞法
胚胎干细胞(ES细胞)是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，将其进行体外培养，扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞，将注射过的胚胎经培养后筛选无发育缺陷的囊胚，移植到交配第3 d的假孕受体动物子宫内，培育出转基因动物。这种办法外源基因整合率较高，但是不易建立ES细胞系。并且在实验过程中要通过嵌合体途径，因此实验周期比较长[11-12]。胚胎干细胞法外源基因的整合率较高，實验者可以在植入囊胚前选择合适转化的ES细胞，避免了以前只能在子代筛选的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是一种目前实验室很有前途的技术。但是它同样存在缺点，比如不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。但是，仍是目前实验室较有前景的一种转基因动物模型制作方法。
4反转录病毒法
反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞的染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎后，将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物[13]。
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该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10 kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达[14]。
5电脉冲法
电脉冲法(electroporation)又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。目前在动物中电脉冲法主要用来转化胚胎干细胞[15]。
以上方法是目前实验室制作转基因动物模型常用的几种方法，各自有其优缺点，适用于不同的转基因模型制作过程。我们以显微注射法为例，简述转基因细胞的制作过程。用显微注射法制作的第一代子鼠为嵌合体子鼠，因此并非子鼠全部细胞中均有导入的外源基因，为了得到纯合子的转基因小鼠，还需用产生的雄性小鼠与提供囊胚的雌性小鼠交配，也称作回交[16]。回交后产生的子代小鼠有两种，野生型与杂合体。将杂合体小鼠互交后产生的子代鼠中会有野生型，杂合体和纯合体三种，通过PCR的方法可以将纯合体挑选出来，再进行繁殖，这样就能够得到稳定的转基因小鼠品系[17-18]。
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转基因动物技术是上世纪八十年代发展起来的一种高新生物技术，近年来得到了飞速发展，转基因动物在生命科学研究中的重要性也越来越受到人们的重视。转基因动物技术的核心，是把遗传的功能单位─基因转移到动物体内，使它成为动物体内的一部分。被转移的基因可以来自同种或异种动物，也可以来自植物或微生物[19]。这样一来，就打破了物种之间的界线，也可以说动物能与植物、微生物杂交了。目前，转基因动物模型大部分局限于单个基因的转移，随着科学技术的发展，我们预料未来会出现多个基因的同时转移，那么转基因动物模型的应用范围又将极大扩展。在转基因动物方面，我国也取得了许多优秀的成果，目前已获得了转基因鱼、兔、鸡等多种转基因动物[20-21]。虽然目前围绕转基因技术的应用仍然存在一些争论，但是我们认为随着科学技术的进一步发展，转基因技术必将拥有更为广泛的应用前景。
参考文献：
[1]刘红林.转基因动物制备技术[J].中国猪业，2016，11(4)：60-61.
, http://www.100md.com
[2]张赟，周国丽，杨冉，等.高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立[J].河南科学，2017，35(2)：204-208.
[3]Jolivet G，Braud S，Dasilva B，et al.Induction of body weight loss through RNAi-knockdown of APOBEC1 gene expression in transgenic rabbits.[J].Plos One，2014，9(9)：e106655.
[4]陈宇浩，马达灵，贺番，等.病毒载体及其在转基因动物中的应用[J].探索科学，2016(9)：379.
[5]余科科，汪思应.转基因小鼠在生命科学中的研究进展[J].医学综述，2015，21(1)：23-24.
[6]董贤慧，高维娟，贺小平，等.淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病转基因模型小鼠大脑皮质DM T1表达的影响[J].重庆医学，2016，45(16)：2176-2179., http://www.100md.com(孙甫 杨姣 吴文焕 王磊 田宇)
2精子导入法
利用雄性精子作为外源性基因，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中的方法称为精子导入法，是制作转基因动物的一种新的方法。此方法把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力，然后用携带有外源基因的精子给母畜受精，在母畜的后代中就会产生一定比例的动物是整合了外源基因的动物。该法简单、方便。与显微注射法，其成本较低，同时不涉及对动物进行手术处理，因此其操作相对简单[9-10]。但在实践过程中仍然发现这种方法成功率较低，而且对于精子是否可作为外源DNA载体也存在争论。因此目前这项技术仍处在早期探索阶段，仍需进一步实验室研究。应用此种方法可以将人工授精、体外受精与转基因结合起来。
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3胚胎干细胞法
胚胎干细胞(ES细胞)是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，将其进行体外培养，扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。本法以整合有外源基因的ES细胞作为供体细胞，将注射过的胚胎经培养后筛选无发育缺陷的囊胚，移植到交配第3 d的假孕受体动物子宫内，培育出转基因动物。这种办法外源基因整合率较高，但是不易建立ES细胞系。并且在实验过程中要通过嵌合体途径，因此实验周期比较长[11-12]。胚胎干细胞法外源基因的整合率较高，實验者可以在植入囊胚前选择合适转化的ES细胞，避免了以前只能在子代筛选的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是一种目前实验室很有前途的技术。但是它同样存在缺点，比如不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。但是，仍是目前实验室较有前景的一种转基因动物模型制作方法。
4反转录病毒法
反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞的染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体，通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒，感染胚胎后，将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫，可发育成携带外源基因的子代动物[13]。
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该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10 kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达[14]。
5电脉冲法
电脉冲法(electroporation)又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。目前在动物中电脉冲法主要用来转化胚胎干细胞[15]。
以上方法是目前实验室制作转基因动物模型常用的几种方法，各自有其优缺点，适用于不同的转基因模型制作过程。我们以显微注射法为例，简述转基因细胞的制作过程。用显微注射法制作的第一代子鼠为嵌合体子鼠，因此并非子鼠全部细胞中均有导入的外源基因，为了得到纯合子的转基因小鼠，还需用产生的雄性小鼠与提供囊胚的雌性小鼠交配，也称作回交[16]。回交后产生的子代小鼠有两种，野生型与杂合体。将杂合体小鼠互交后产生的子代鼠中会有野生型，杂合体和纯合体三种，通过PCR的方法可以将纯合体挑选出来，再进行繁殖，这样就能够得到稳定的转基因小鼠品系[17-18]。
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转基因动物技术是上世纪八十年代发展起来的一种高新生物技术，近年来得到了飞速发展，转基因动物在生命科学研究中的重要性也越来越受到人们的重视。转基因动物技术的核心，是把遗传的功能单位─基因转移到动物体内，使它成为动物体内的一部分。被转移的基因可以来自同种或异种动物，也可以来自植物或微生物[19]。这样一来，就打破了物种之间的界线，也可以说动物能与植物、微生物杂交了。目前，转基因动物模型大部分局限于单个基因的转移，随着科学技术的发展，我们预料未来会出现多个基因的同时转移，那么转基因动物模型的应用范围又将极大扩展。在转基因动物方面，我国也取得了许多优秀的成果，目前已获得了转基因鱼、兔、鸡等多种转基因动物[20-21]。虽然目前围绕转基因技术的应用仍然存在一些争论，但是我们认为随着科学技术的进一步发展，转基因技术必将拥有更为广泛的应用前景。
参考文献：
[1]刘红林.转基因动物制备技术[J].中国猪业，2016，11(4)：60-61.
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[2]张赟，周国丽，杨冉，等.高G-C含量突变型Foxo1转基因动物基因型鉴定PCR方法的建立[J].河南科学，2017，35(2)：204-208.
[3]Jolivet G，Braud S，Dasilva B，et al.Induction of body weight loss through RNAi-knockdown of APOBEC1 gene expression in transgenic rabbits.[J].Plos One，2014，9(9)：e106655.
[4]陈宇浩，马达灵，贺番，等.病毒载体及其在转基因动物中的应用[J].探索科学，2016(9)：379.
[5]余科科，汪思应.转基因小鼠在生命科学中的研究进展[J].医学综述，2015，21(1)：23-24.
[6]董贤慧，高维娟，贺小平，等.淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对阿尔茨海默病转基因模型小鼠大脑皮质DM T1表达的影响[J].重庆医学，2016，45(16)：2176-2179., http://www.100md.com(孙甫 杨姣 吴文焕 王磊 田宇)