不同雷公藤制剂中6个成分的含量研究(2)
中药雷公藤(tripterygium wilfordii)属于卫矛科雷公藤属藤本植物，主要分布于中国东部及南部，具有抗炎、抑制免疫、抗肿瘤等作用，现广泛应用于治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肾病综合征和癌症等多种疾病[1，2]。目前雷公藤制剂是治疗慢性肾炎是最为有效的中成药之一，包括火把花根片、雷公藤多苷片、昆仙胶囊等。但雷公藤制剂投入临床使用以来，相关不良反应仍时有报道，主要存在于消化道系统、泌尿系统、生殖系统、神经系统、皮肤黏膜、血液系统，主要原因在于雷公藤所含的主要活性成分二萜类、生物碱类、三萜类在产生毒性的同时又发挥着药理作用，如雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分[3，4]。此外雷公藤通常以单一成分作为提取指标，不能反映雷公藤提取物的整体情况，加上雷公藤提取工艺多样化，各工艺质量存在差异化，无法判定其科学性、合理性、可行性、优劣性。故存在着临床用药安全性的威胁。临床实践证明：上述单体成分相同但含量不同的雷公藤制剂在治疗作用及副作用发生率方面存在明显差异。为探讨其内在质量，确保临床疗效稳定可靠，本实验基于现有的研究基础上[5-8]，采用高效液相色谱(HPLC)法测定雷公藤多苷片中6种成分即雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素及雷公藤内酯甲的含量，为评价雷公藤制剂的质量提供参考手段。
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1仪器与试药
1.1仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪(上海纳锘仪器有限公司)，HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)，AUW220D电子天平(日本岛津公司)，HKD1002VS型数控超声波清洗器(深圳市和科达超声设备有限公司)，Aquelix 5实验室纯水机(美国默克密理博公司)。
1.2试药 雷公藤多苷片(江苏美通制药有限公司，批号为20160701，160401);昆明山海棠片(云南植物药业有限公司，批号为20150508-025，20160302);昆仙胶囊(广州白云山陈李济药厂有限公司，批号为D31001);雷公藤甲素(批号150713，纯度不少于98%)、雷公藤内酯酮(150805，纯度不少于98%)、雷酚内酯(150826，纯度不少于98%)、雷公藤次碱(150614，纯度不少于98%)、雷公藤红素(150627，纯度不少于98%)、雷公藤内酯甲(160107，纯度不少于98%)均购于四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、三氯甲烷、乙酸铵为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。
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2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：流动相A为10 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～15 min，90%A→65%A;15～22 min，65%A→65%A;22～30 min，65%A→45%A;30～35 min，45%A;35～40 min，45%A→40%A;40～70 min，40%A→15%A;70～75 min，15%A→5%A;75～80 min，5%A→90%A);流速0.75 ml/min;进样量20 μl;检测波长：225 nm;柱温：25 ℃。色譜图见图1。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液 分别取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤内酯甲适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为1 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml的单个对照品贮备液。
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2.2.2供试品溶液 取样品适量，研细，精密称取药粉约0.15 g，置25 ml量瓶中，用氯仿溶解后定容。精密移取5 ml，加于硅胶层析柱(100～200目，6 g，内径为10～15 mm)，用氯仿-甲醇(97∶3)洗脱3次，每次25 ml，收集洗脱液，蒸干，残渣加2 ml甲醇使溶解，即得。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察 分别精密吸取以上对照品贮备液适量，混匀，加甲醇逐级稀释，分别制得质量浓度在0.09～156.5 μg/ml 6个浓度的对照品溶液，分别吸取20 μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品进样量(X，μg)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好，见表1。
2.3.2精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μl，连续进样6次，计算峰面积。结果雷公藤甲素峰面积RSD=0.87%(n=6);雷公藤内酯酮峰面积RSD=0.43%(n=6);雷酚内酯峰面积RSD=0.03%(n=6);雷公藤次碱峰面积RSD=0.08%(n=6);雷公藤红素峰面积RSD=0.35%(n=6);雷公藤内酯甲峰面积RSD=0.98%(n=6)。表明仪器精密度良好。
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2.3.3稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在室温下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，分别进样20 μl，记录峰面积。结果：雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤内酯甲的峰面积RSD值分别为1.2%、1.5%、1.7%、1.8%、1.4%、1.3%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4重复性试验 称取同一批样品(批号：160401)6份，依法制备供试品溶液，按拟定色谱条件依次进样，记录峰面积。结果雷公藤甲素平均峰面积RSD=1.01%(n=6);雷公藤内酯酮平均峰面积RSD=1.72%(n=6);雷酚内酯平均峰面积RSD=0.69%(n=6);雷公藤次碱平均峰面积RSD=0.93%(n=6);雷公藤红素平均峰面积RSD=1.22%(n=6);雷公藤内酯甲平均峰面积RSD=1.77%(n=6)。表明本法重复性好。, http://www.100md.com(祁爱蓉 傅博 刘小燕 李顺民 文善适 郑平 陈剑平)
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1仪器与试药
1.1仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪(上海纳锘仪器有限公司)，HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)，AUW220D电子天平(日本岛津公司)，HKD1002VS型数控超声波清洗器(深圳市和科达超声设备有限公司)，Aquelix 5实验室纯水机(美国默克密理博公司)。
1.2试药 雷公藤多苷片(江苏美通制药有限公司，批号为20160701，160401);昆明山海棠片(云南植物药业有限公司，批号为20150508-025，20160302);昆仙胶囊(广州白云山陈李济药厂有限公司，批号为D31001);雷公藤甲素(批号150713，纯度不少于98%)、雷公藤内酯酮(150805，纯度不少于98%)、雷酚内酯(150826，纯度不少于98%)、雷公藤次碱(150614，纯度不少于98%)、雷公藤红素(150627，纯度不少于98%)、雷公藤内酯甲(160107，纯度不少于98%)均购于四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、三氯甲烷、乙酸铵为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。
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2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：流动相A为10 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～15 min，90%A→65%A;15～22 min，65%A→65%A;22～30 min，65%A→45%A;30～35 min，45%A;35～40 min，45%A→40%A;40～70 min，40%A→15%A;70～75 min，15%A→5%A;75～80 min，5%A→90%A);流速0.75 ml/min;进样量20 μl;检测波长：225 nm;柱温：25 ℃。色譜图见图1。
2.2溶液制备
2.2.1对照品溶液 分别取雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤内酯甲适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释，制成质量浓度分别为1 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml、1 mg/ml、1 mg/ml的单个对照品贮备液。
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2.2.2供试品溶液 取样品适量，研细，精密称取药粉约0.15 g，置25 ml量瓶中，用氯仿溶解后定容。精密移取5 ml，加于硅胶层析柱(100～200目，6 g，内径为10～15 mm)，用氯仿-甲醇(97∶3)洗脱3次，每次25 ml，收集洗脱液，蒸干，残渣加2 ml甲醇使溶解，即得。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察 分别精密吸取以上对照品贮备液适量，混匀，加甲醇逐级稀释，分别制得质量浓度在0.09～156.5 μg/ml 6个浓度的对照品溶液，分别吸取20 μl注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品进样量(X，μg)为横坐标、峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程。结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好，见表1。
2.3.2精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μl，连续进样6次，计算峰面积。结果雷公藤甲素峰面积RSD=0.87%(n=6);雷公藤内酯酮峰面积RSD=0.43%(n=6);雷酚内酯峰面积RSD=0.03%(n=6);雷公藤次碱峰面积RSD=0.08%(n=6);雷公藤红素峰面积RSD=0.35%(n=6);雷公藤内酯甲峰面积RSD=0.98%(n=6)。表明仪器精密度良好。
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2.3.3稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，在室温下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，分别进样20 μl，记录峰面积。结果：雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素、雷公藤内酯甲的峰面积RSD值分别为1.2%、1.5%、1.7%、1.8%、1.4%、1.3%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4重复性试验 称取同一批样品(批号：160401)6份，依法制备供试品溶液，按拟定色谱条件依次进样，记录峰面积。结果雷公藤甲素平均峰面积RSD=1.01%(n=6);雷公藤内酯酮平均峰面积RSD=1.72%(n=6);雷酚内酯平均峰面积RSD=0.69%(n=6);雷公藤次碱平均峰面积RSD=0.93%(n=6);雷公藤红素平均峰面积RSD=1.22%(n=6);雷公藤内酯甲平均峰面积RSD=1.77%(n=6)。表明本法重复性好。, http://www.100md.com(祁爱蓉 傅博 刘小燕 李顺民 文善适 郑平 陈剑平)