泛耐药鲍氏不动杆菌氨基糖苷类耐药相关基因研究(2)
1.1 细菌来源 20株XDRAB均分离自2014年1月～12月黄石市中心医院住院患者各种标本鉴定的菌株，每位患者一株菌。
1.2 菌种鉴定和药敏试验 全部XDRAB经鲍氏不动杆菌种特异基因mdfA检测确认。药敏试验采用K-B纸片琼脂扩散法测定菌株对抗菌药物的抑菌环直径。药敏纸片为英国Oxoid公司产品，培养基为法国生物梅里埃公司产品，结果判断按美国临床实验室标准协会(CLSI)2013版执行。
1.3细菌DNA制备 蛋白酶K水解离心快速裂解法。
1.4基因检测 耐药元件检测均为聚合酶链反应(PCR)法(全部PCR引物和商品化PCR盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供)。20株XDRAB耐药元件检测项目：9种氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、ant(4')-Ⅰ、aph3'-Ⅰ;6种16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;1种获得性外排泵泵蛋白基因adeB，靶基因引物识别序列和目的产物长度，见表1。
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2结果
2.1 XDRAB药敏试验 20株XDRAB对17种抗菌药物：哌拉西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美洛培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素、米诺环素、四环素、多粘菌素。耐药率：除了对多粘菌素全部敏感外，对其他抗菌药物耐药率均在80.00%以上。
2.2泛耐药鲍氏不动杆菌标本临床来源分布情况及患者基本情况 20株泛耐药鲍氏不动杆菌中，12株来源于重症监护病房，8株来源于神经外科病房，多为气管插管、导尿管的使用、导管留置时间延迟等各种侵入性操作的患者。
2.3 基因检测结果 20株泛耐药鲍氏不动杆菌共检出4种氨基糖苷类获得性耐药基因，氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ阳性率15.0%;ant(3")-Ⅰ阳性率20.0%;aph3'-Ⅰ阳性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未检出;外排泵adeB基因阳性率95.0%，见表2。
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2.4 阳性耐药基因PCR电泳图 阳性耐药基因(aac(3)-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、adeB)PCR电泳图，见图1。
3讨论
临床致病菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药机制主要为[4-8]：①氨基糖苷类修饰酶基因的产生;②外膜蛋白的通透性改变以及药物外排泵的激活和过度表达;③核糖体结合位点的改变，其中最常见的原因是耐药机制一。
鲍曼不动杆菌是医院内感染的重要病原菌之一，从我们的实验中可以看出，20株鲍曼不动杆菌中，3株aac(3)-Ⅰ基因阳性，4株ant(3")-Ⅰ基因阳性，20株aph3'-Ⅰ基因阳性，提示我院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带耐药相关基因有关。
近年来，国外和我国台湾地区报道了在临床分离菌中发现了一类新耐氨基糖苷类抗菌药物的酶16S rRNA 甲基化酶，由质粒介导，能使该类抗菌药物的作用靶位甲基化，使药物无法结合到细菌16SrRNA，导致所有该类抗菌药物高水平耐药[9，10]。由16S rRNA甲基化酶基因介导的高水平氨基糖苷类抗菌药物耐药引起学者越来越多的关注， 到目前为止， 已发现6种16SrRNA 甲基化酶(armA 、rmtA、rmtB、rm tC 、rmtD、npmA)，本实验虽然未检出16SrRNA 甲基化酶基因，但依然要加强抗菌药物合理使用和医院感染控制， 避免16SrRNA甲基化酶基因的播散。
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本次研究发现，耐药不动杆菌属中，外排泵基因数量高于不耐药不动杆菌属[11-13]，提示外排泵基因在细菌耐药表型中也起作用。本研究检测了adeB外排泵基因，adeB基因编码内膜外排泵，是鲍氏不动杆菌外排泵Ade ABC中重要的组成系统，本组19株adeB基因阳性，提示本院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带ade B外排泵基因有关。
参考文献：
[1]Kim Y，Bae IK，Jeong SH，et al.In Vivo Selection of Pan-Drug Resistant Acinetobacter baumannii during Antibiotic Treatment[J].Yonsei Med J，2014，56(4)：928-934.
[2]Ning F，Shen Y，Chen X，et al.A combination regimen of meropenem，cefoperazone-sulbactam and minocycline for extensive burns with pan-drug resistant Acinetobacter baumannii infection[J].Chin Med J (Engl)，2014，127(6)：1177-1179.
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[3]Zarrilli R，Di Popolo A，Bagattini M，et al.Clonal spread and patient risk factors for acquisition of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in a neonatal intensive care unit in Italy[J].J Hosp Infect，2012，82(4)：260-265.
[4]邢丽丹，糜祖煌，徐鑫鑫，等.36株多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药基因的流行病学研究[J].中国感染与化疗杂志，2013，13(6)：442-445.
[5]宋彩虹，陆水英，张秀瑜，等.鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析[J].中国微生態学杂志，2013，25(2)：161-164.
[6]刘薇，李禄俊，龙云，等.2012年某院鲍曼不动杆菌感染分布及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2014，35(5)：576-577.
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[7]陈璐，李凌竹，刘宝，等.耐碳青霉烯鲍氏不动杆菌耐药性与耐药基因检出关系探讨[J].中华医院感染学杂志，2016，26(17)：3848-3851.
[8]马云华，张志军，苏芬，等.多重耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类耐药基因的研究[J].国际检验医学杂志，2017，38(2)：151-152.
[9]翁幸鐾，糜祖煌.可移动遗传元件：耐药基因的载体[J].中国人兽共患病学报，2013，29(4)：389-397.
[10]郑丹，翁幸鐾，袁求文，等.泛耐药鲍氏不动杆菌β-内酰胺类与氨基糖苷类耐药元件研究[J].中华医院感染学杂志，2016，26(7)：1465-1467.
[11]周云，凌保东.4种外排泵抑制剂对鲍曼不动杆菌耐药性的抑制影响[J].中国抗生素杂志，2013，38(6)：461-466.
[12]周秩权，周建伟，夏忠弟.泮托拉唑对耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌主动外排泵的抑制作用[J].医学信息，2014，27(19)：194-195.
[13]张立然，刘原，柯蕊，等.鲍曼不动杆菌adeB基因检测及外排泵抑制剂逆转亚胺培南耐药性的研究[J].中国抗生素杂志，2017，42(1)：62-66., http://www.100md.com(鲍群丽 柯俊 胡芳 张利红 黄艳 程攀 彭紫檀 汪宏良)
1.2 菌种鉴定和药敏试验 全部XDRAB经鲍氏不动杆菌种特异基因mdfA检测确认。药敏试验采用K-B纸片琼脂扩散法测定菌株对抗菌药物的抑菌环直径。药敏纸片为英国Oxoid公司产品，培养基为法国生物梅里埃公司产品，结果判断按美国临床实验室标准协会(CLSI)2013版执行。
1.3细菌DNA制备 蛋白酶K水解离心快速裂解法。
1.4基因检测 耐药元件检测均为聚合酶链反应(PCR)法(全部PCR引物和商品化PCR盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供)。20株XDRAB耐药元件检测项目：9种氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰad、aac(6')-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2")-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、ant(4')-Ⅰ、aph3'-Ⅰ;6种16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA;1种获得性外排泵泵蛋白基因adeB，靶基因引物识别序列和目的产物长度，见表1。
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2结果
2.1 XDRAB药敏试验 20株XDRAB对17种抗菌药物：哌拉西林、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、美洛培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、氯霉素、米诺环素、四环素、多粘菌素。耐药率：除了对多粘菌素全部敏感外，对其他抗菌药物耐药率均在80.00%以上。
2.2泛耐药鲍氏不动杆菌标本临床来源分布情况及患者基本情况 20株泛耐药鲍氏不动杆菌中，12株来源于重症监护病房，8株来源于神经外科病房，多为气管插管、导尿管的使用、导管留置时间延迟等各种侵入性操作的患者。
2.3 基因检测结果 20株泛耐药鲍氏不动杆菌共检出4种氨基糖苷类获得性耐药基因，氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ阳性率15.0%;ant(3")-Ⅰ阳性率20.0%;aph3'-Ⅰ阳性率100.00%;16SrRNA甲基化酶未检出;外排泵adeB基因阳性率95.0%，见表2。
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2.4 阳性耐药基因PCR电泳图 阳性耐药基因(aac(3)-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、adeB)PCR电泳图，见图1。
3讨论
临床致病菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药机制主要为[4-8]：①氨基糖苷类修饰酶基因的产生;②外膜蛋白的通透性改变以及药物外排泵的激活和过度表达;③核糖体结合位点的改变，其中最常见的原因是耐药机制一。
鲍曼不动杆菌是医院内感染的重要病原菌之一，从我们的实验中可以看出，20株鲍曼不动杆菌中，3株aac(3)-Ⅰ基因阳性，4株ant(3")-Ⅰ基因阳性，20株aph3'-Ⅰ基因阳性，提示我院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带耐药相关基因有关。
近年来，国外和我国台湾地区报道了在临床分离菌中发现了一类新耐氨基糖苷类抗菌药物的酶16S rRNA 甲基化酶，由质粒介导，能使该类抗菌药物的作用靶位甲基化，使药物无法结合到细菌16SrRNA，导致所有该类抗菌药物高水平耐药[9，10]。由16S rRNA甲基化酶基因介导的高水平氨基糖苷类抗菌药物耐药引起学者越来越多的关注， 到目前为止， 已发现6种16SrRNA 甲基化酶(armA 、rmtA、rmtB、rm tC 、rmtD、npmA)，本实验虽然未检出16SrRNA 甲基化酶基因，但依然要加强抗菌药物合理使用和医院感染控制， 避免16SrRNA甲基化酶基因的播散。
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本次研究发现，耐药不动杆菌属中，外排泵基因数量高于不耐药不动杆菌属[11-13]，提示外排泵基因在细菌耐药表型中也起作用。本研究检测了adeB外排泵基因，adeB基因编码内膜外排泵，是鲍氏不动杆菌外排泵Ade ABC中重要的组成系统，本组19株adeB基因阳性，提示本院多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药与携带ade B外排泵基因有关。
参考文献：
[1]Kim Y，Bae IK，Jeong SH，et al.In Vivo Selection of Pan-Drug Resistant Acinetobacter baumannii during Antibiotic Treatment[J].Yonsei Med J，2014，56(4)：928-934.
[2]Ning F，Shen Y，Chen X，et al.A combination regimen of meropenem，cefoperazone-sulbactam and minocycline for extensive burns with pan-drug resistant Acinetobacter baumannii infection[J].Chin Med J (Engl)，2014，127(6)：1177-1179.
, 百拇医药
[3]Zarrilli R，Di Popolo A，Bagattini M，et al.Clonal spread and patient risk factors for acquisition of extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in a neonatal intensive care unit in Italy[J].J Hosp Infect，2012，82(4)：260-265.
[4]邢丽丹，糜祖煌，徐鑫鑫，等.36株多重耐药鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物耐药基因的流行病学研究[J].中国感染与化疗杂志，2013，13(6)：442-445.
[5]宋彩虹，陆水英，张秀瑜，等.鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析[J].中国微生態学杂志，2013，25(2)：161-164.
[6]刘薇，李禄俊，龙云，等.2012年某院鲍曼不动杆菌感染分布及耐药性分析[J].国际检验医学杂志，2014，35(5)：576-577.
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[7]陈璐，李凌竹，刘宝，等.耐碳青霉烯鲍氏不动杆菌耐药性与耐药基因检出关系探讨[J].中华医院感染学杂志，2016，26(17)：3848-3851.
[8]马云华，张志军，苏芬，等.多重耐药鲍曼不动杆菌氨基糖苷类耐药基因的研究[J].国际检验医学杂志，2017，38(2)：151-152.
[9]翁幸鐾，糜祖煌.可移动遗传元件：耐药基因的载体[J].中国人兽共患病学报，2013，29(4)：389-397.
[10]郑丹，翁幸鐾，袁求文，等.泛耐药鲍氏不动杆菌β-内酰胺类与氨基糖苷类耐药元件研究[J].中华医院感染学杂志，2016，26(7)：1465-1467.
[11]周云，凌保东.4种外排泵抑制剂对鲍曼不动杆菌耐药性的抑制影响[J].中国抗生素杂志，2013，38(6)：461-466.
[12]周秩权，周建伟，夏忠弟.泮托拉唑对耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌主动外排泵的抑制作用[J].医学信息，2014，27(19)：194-195.
[13]张立然，刘原，柯蕊，等.鲍曼不动杆菌adeB基因检测及外排泵抑制剂逆转亚胺培南耐药性的研究[J].中国抗生素杂志，2017，42(1)：62-66., http://www.100md.com(鲍群丽 柯俊 胡芳 张利红 黄艳 程攀 彭紫檀 汪宏良)