1.3实验方法

    1.3.1切片制备 载玻片采用挂胶片，由有经验的同一名技师进行完整切片，切片厚度均为5 μm。

    1.3.2免疫荧光定位及双标步骤 所有实验标本均按以下程序处理：①烤片：70 ℃恒温培养箱烤片约3 h后原位放置2 h。②组织脱蜡和水化：二甲苯连续脱蜡(Ⅰa Ⅰb Ⅱa Ⅱb)各10 min；无水乙醇 、95%乙醇、 75%乙醇梯度脱二甲苯各 6 min，后分别用蒸馏水冲洗；③修复抗原：将配制好的EDTA修复液在微波炉上加热，沸腾后将脱苯的组织切片放入高压锅中，上气开始记时2 min，关闭微波炉，冷却至室温；④血清封闭：取出切片蒸馏水冲洗后擦干，滴加 3%H2O2，湿盒内常温下静置20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净，封闭内源性过氧化物酶；滴加正常羊血清，湿盒内37 ℃ 孵育20 min；⑤一抗孵育：等体积Survivin与Ki67 工作液混合，甩去切片上清液，滴加混合一抗，湿盒内4 ℃孵育过夜；⑥二抗孵育：分别滴加TRITC标记二抗工作液(FSHR/GnRHR 抗体)：次日晨8时将湿盒取出并恢复至室温，将TRITC标记山羊抗兔 IgG 以1∶100 稀释，滴加至切片上，湿盒内37 ℃孵育30 min；再滴加FITC标记二抗工作液(FSHR/GnRHR 抗体)：玻片由湿盒取出抛去水滴自然晾干20 min ......