流式细胞术研究细胞增殖的方法与技术(2)
DRAQ5是可发射远红外荧光的蒽醌类染料，激发光谱在很宽范围内，流式细胞仪配备的488 nm、561 nm、633 nm激光器均可对其有效激发，但以633 nm激发效果最佳，DRAQ5具有膜通透，可对活细胞和固定的细胞进行DNA染色分析[7]，由于它主要和DNA双链结合，和RNA的亲和力小，因此染色过程中样本无需RNase消化，利用633 nm激发光，670 nm发射光检测DRAQ5标记细胞周期时，可与FITC、PE、GFP等荧光素同时标记较少发生光谱重叠。
1.3染色的结果分析 以上所介绍的几种染料，激发和发射光谱不同，但染色原理大致相同，都是根据染料的荧光道数与DNA含量成正比这一单一变量检测，因此，只能根据DNA含量区分出G0/G1期，S期和G2/M期，而无法进一步区分出DNA含量相同的G0和G1期，G2和M期。由于处于不同时相的细胞对药物或处理会有不同的反应，因此体外培养的细胞在进行干预前应进行同步化处理，否则会影响实验的重复性。细胞同步化的方法包括、短时间饥饿、照射、低温法、药物抑制等物理或化学方法，血清饥饿法因对细胞本身的干扰小且能够获得大量的G0/G1期细胞因此而最为常用[8-10]。此外，在检测样品的过程中还应注意粘连体细胞的排除，两个2C细胞粘连在一起，在流式细胞仪上检测到的DNA的含量为4C，但由于两个粘连细胞比单个细胞通过激光束的时间长，因此脉冲的宽度是大于单个细胞的，可以利用荧光通道的脉冲宽度信号W的差异进行排除。
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对于分析癌变细胞或肿瘤活检组织的DNA含量时，通常引入DNA指数(DI)的概念，即(样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)/(正常二倍体细胞样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)，理论上正常二倍体细胞DI=1，由于实际检测存在变异系数，实际检测到二倍体DI值为0.9～1.0，四倍体DI值为1.9～2.1，DI值对于临床上肿瘤的诊断具有一定的参考价值。可以使用鸡红细胞或正常人的淋巴细胞作对照来确定二倍体细胞[11]，市面上也有商品化的小鸡红细胞核(CEN)用于调节二倍体峰的位置。DNA含量的检测结果通常利用周期分析软件进行S期划定，一般2C峰和4C峰比较对称，且变异系数CV较小结果比较准确，若CV>8，则无法正确分析出各期细胞比例，目前市面上常用的周期分析软件有Muticycle、ModitLT和Flowjo等，同样样品结果利用不同软件分析各期比例无显著性差异[12]。
2示踪染料标记法
2.1 BrdU和EdU掺入法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)，是人工合成的胸腺嘧啶类似物，在DNA合成期(S期)，BrdU能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中，用荧光标记的BrdU抗体进行染色，就可以标记出处于增殖期的细胞，同时结合7-AAD进行DNA染色，可清晰的将细胞区分出G0/G1期，S期和G2/M期[13]。BrdU/7-AAD双参数法的优势在于S期的判定，实验结果无需利用软件分析即可区分各期细胞。在这个方案中，根据所用仪器的激光配置，可选择BrdU与FITC或APC等不同荧光素连接的抗体，7-AAD也可被PI替代。目前BrdU有一大缺点，BrdU抗体分子较大，双链DNA中的碱基对阻碍BrdU与抗体的结合，因此需将DNA双链打开后，若DNA结构打开不充分，BrdU与荧光抗体结合不佳，导致检测到的荧光信号不能真实准确的反映BrdU 的含量，为了能够暴露BrdU的抗原表位，通常用高浓度的盐酸，乙酸或酶解使得DNA变性，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)也是一種胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，它与荧光素的结合一种被称作“click”化学作用的Cu+催化的环加成作用，而非抗原抗体反应。与传统的免疫荧光染色比较，Edu反应非常快速，且无需对DNA双链变性，有效地避免了样品损伤，检测细胞增殖具有更高的灵敏度和更快的检测速度，能在组织和细胞水平反映细胞增殖情况[14，15]。
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2.2 CFSE标记法 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE)是目前应用广泛的一种检测细胞增殖的染料，CFSE的前体羧基荧光二乙酸盐素琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein diactate succinimidyl ester，CFSE-SE)是没有荧光的，但可自由透过细胞膜进入细胞，进入细胞后，其乙酸基团被胞内酯酶切除后，可产生具有荧光的CFSE，CFSE不可逆地细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上并且长时间存在于细胞内。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白平均分配到两个第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半，再次分裂后，第三代细胞的荧光强度会比第二代再减弱一半，以此类推，细胞增殖代数越多，得到细胞的平均荧光强度相比第一代减弱更明显，利用流式细胞仪488 nm激光激发，520 nm接收可检测到细胞CFSE染色荧光，从而反映细胞的增殖情况。
CFSE探针多用于各种干细胞，淋巴细胞的增殖研究中[16，17]，可用于体外培养细胞分裂跟踪，也可用于注入动物器官内观测细胞体内增殖。由于CFSE对细胞是有一定毒性作用的，因此，染色浓度及时间对细胞增殖、分化存在着影响。有研究指出，CFSE对细胞进行染色时呈现浓度依赖型[18]，细胞的荧光随着CFSE 染色终浓度升高而增强，但随着染色浓度的增大，CFSE的细胞毒性也逐渐体现出来，在一定程度上可引起细胞的凋亡，不同种类的细胞CFSE的最佳标记浓度有所区别，最佳的染色浓度是使父代细胞荧光强度比未染色细胞高3～3.5个数量级[19]。CFSE染色的持续时间也很重要，孵育时间过长，可增加细胞毒性[20]，体外培养细胞孵育时间一般控制在10 min内，而后用40%体积的冷小牛血清终止标记10 min后重悬细胞。此外，培养体系或缓冲液中若存在游离氨基酸，会与CFSE结合而影响其染色效果，因此推荐用PBS配制工作液。对于检测结果的分析，可利用ModitLT软件进行增值代数的划定或直接进行细胞平均荧光强度的比较。, 百拇医药(户乃丽)
1.3染色的结果分析 以上所介绍的几种染料，激发和发射光谱不同，但染色原理大致相同，都是根据染料的荧光道数与DNA含量成正比这一单一变量检测，因此，只能根据DNA含量区分出G0/G1期，S期和G2/M期，而无法进一步区分出DNA含量相同的G0和G1期，G2和M期。由于处于不同时相的细胞对药物或处理会有不同的反应，因此体外培养的细胞在进行干预前应进行同步化处理，否则会影响实验的重复性。细胞同步化的方法包括、短时间饥饿、照射、低温法、药物抑制等物理或化学方法，血清饥饿法因对细胞本身的干扰小且能够获得大量的G0/G1期细胞因此而最为常用[8-10]。此外，在检测样品的过程中还应注意粘连体细胞的排除，两个2C细胞粘连在一起，在流式细胞仪上检测到的DNA的含量为4C，但由于两个粘连细胞比单个细胞通过激光束的时间长，因此脉冲的宽度是大于单个细胞的，可以利用荧光通道的脉冲宽度信号W的差异进行排除。
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对于分析癌变细胞或肿瘤活检组织的DNA含量时，通常引入DNA指数(DI)的概念，即(样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)/(正常二倍体细胞样品G0/G1期细胞峰的平均荧光道数)，理论上正常二倍体细胞DI=1，由于实际检测存在变异系数，实际检测到二倍体DI值为0.9～1.0，四倍体DI值为1.9～2.1，DI值对于临床上肿瘤的诊断具有一定的参考价值。可以使用鸡红细胞或正常人的淋巴细胞作对照来确定二倍体细胞[11]，市面上也有商品化的小鸡红细胞核(CEN)用于调节二倍体峰的位置。DNA含量的检测结果通常利用周期分析软件进行S期划定，一般2C峰和4C峰比较对称，且变异系数CV较小结果比较准确，若CV>8，则无法正确分析出各期细胞比例，目前市面上常用的周期分析软件有Muticycle、ModitLT和Flowjo等，同样样品结果利用不同软件分析各期比例无显著性差异[12]。
2示踪染料标记法
2.1 BrdU和EdU掺入法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)，是人工合成的胸腺嘧啶类似物，在DNA合成期(S期)，BrdU能够代替胸腺嘧啶而渗入正在复制的DNA分子中，用荧光标记的BrdU抗体进行染色，就可以标记出处于增殖期的细胞，同时结合7-AAD进行DNA染色，可清晰的将细胞区分出G0/G1期，S期和G2/M期[13]。BrdU/7-AAD双参数法的优势在于S期的判定，实验结果无需利用软件分析即可区分各期细胞。在这个方案中，根据所用仪器的激光配置，可选择BrdU与FITC或APC等不同荧光素连接的抗体，7-AAD也可被PI替代。目前BrdU有一大缺点，BrdU抗体分子较大，双链DNA中的碱基对阻碍BrdU与抗体的结合，因此需将DNA双链打开后，若DNA结构打开不充分，BrdU与荧光抗体结合不佳，导致检测到的荧光信号不能真实准确的反映BrdU 的含量，为了能够暴露BrdU的抗原表位，通常用高浓度的盐酸，乙酸或酶解使得DNA变性，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)也是一種胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，EdU只有BrdU抗体大小的1/500，它与荧光素的结合一种被称作“click”化学作用的Cu+催化的环加成作用，而非抗原抗体反应。与传统的免疫荧光染色比较，Edu反应非常快速，且无需对DNA双链变性，有效地避免了样品损伤，检测细胞增殖具有更高的灵敏度和更快的检测速度，能在组织和细胞水平反映细胞增殖情况[14，15]。
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2.2 CFSE标记法 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE)是目前应用广泛的一种检测细胞增殖的染料，CFSE的前体羧基荧光二乙酸盐素琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein diactate succinimidyl ester，CFSE-SE)是没有荧光的，但可自由透过细胞膜进入细胞，进入细胞后，其乙酸基团被胞内酯酶切除后，可产生具有荧光的CFSE，CFSE不可逆地细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上并且长时间存在于细胞内。当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白平均分配到两个第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半，再次分裂后，第三代细胞的荧光强度会比第二代再减弱一半，以此类推，细胞增殖代数越多，得到细胞的平均荧光强度相比第一代减弱更明显，利用流式细胞仪488 nm激光激发，520 nm接收可检测到细胞CFSE染色荧光，从而反映细胞的增殖情况。
CFSE探针多用于各种干细胞，淋巴细胞的增殖研究中[16，17]，可用于体外培养细胞分裂跟踪，也可用于注入动物器官内观测细胞体内增殖。由于CFSE对细胞是有一定毒性作用的，因此，染色浓度及时间对细胞增殖、分化存在着影响。有研究指出，CFSE对细胞进行染色时呈现浓度依赖型[18]，细胞的荧光随着CFSE 染色终浓度升高而增强，但随着染色浓度的增大，CFSE的细胞毒性也逐渐体现出来，在一定程度上可引起细胞的凋亡，不同种类的细胞CFSE的最佳标记浓度有所区别，最佳的染色浓度是使父代细胞荧光强度比未染色细胞高3～3.5个数量级[19]。CFSE染色的持续时间也很重要，孵育时间过长，可增加细胞毒性[20]，体外培养细胞孵育时间一般控制在10 min内，而后用40%体积的冷小牛血清终止标记10 min后重悬细胞。此外，培养体系或缓冲液中若存在游离氨基酸，会与CFSE结合而影响其染色效果，因此推荐用PBS配制工作液。对于检测结果的分析，可利用ModitLT软件进行增值代数的划定或直接进行细胞平均荧光强度的比较。, 百拇医药(户乃丽)